Method Article

Livraison bactérienne de l'ARNi Effectors: Transkingdom ARNi

DOI:

10.3791/2099

August 18th, 2010

In This Article

Summary

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Pour le développement de l'interférence ARN (ARNi) thérapies basées sur une nouvelle stratégie a été développée, transkingdom ARNi (tkRNAi). Cette technologie utilise des bactéries non pathogènes pour produire et livrer en épingle à cheveux courts ARN thérapeutiques (shRNA) dans les cellules cibles. Ici, tkRNAi a été appliquée avec succès pour le renversement de la multirésistance classique ABCB1 médiation (MDR) des cellules cancéreuses.

Abstract

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L'interférence ARN (ARNi) représente un mécanisme de haute efficace pour l'inhibition spécifique de l'expression de l'ARNm. Outre son potentiel comme outil de laboratoire puissant, la voie de l'ARNi semble être prometteuse pour l'utilisation thérapeutique. Pour le développement de l'interférence ARN (ARNi) basé sur les thérapies, la livraison de l'ARNi médiation des agents à des cellules cibles est l'un des obstacles majeurs. Une nouvelle stratégie pour surmonter cet obstacle est transkingdom ARNi (tk ARNi). Cette technologie utilise des bactéries non pathogènes, par exemple, Escherichia coli, pour produire et livrer en épingle à cheveux courts ARN thérapeutiques (shRNA) dans les cellules cibles pour induire l'ARNi. Une première génération tk ARNi médiation vecteur, TRIP, contient le promoteur du bactériophage T7 pour régulation de l'expression d'un shRNA thérapeutiques d'intérêt. Par ailleurs, TRIP a le locus Inv partir de Yersinia pseudotuberculosis qui encode invasine, qui permet naturelle des bactéries non invasives d'entrer β1-intégrine-positif cellules de mammifères et le gène HlyA partir de la bactérie Listeria monocytogenes, qui produit listériolysine O. Cet enzyme permet le shRNA thérapeutiques pour échapper à d'entrée des vésicules dans le cytoplasme de la cellule cible. Construit TRIP sont introduits dans une compétents souche non pathogène Escherichia coli, qui code T7 RNA polymérase nécessaire à l'promoteur T7 axée synthèse de shRNA. Une molécule cible bien caractérisé associée au cancer pour les stratégies de RNAi différents ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Ce ABC-transporteur agit comme une pompe d'extrusion de drogue et médiatise la "classique" multirésistance ABCB1 médiation (MDR) phénotype des cellules cancéreuses humaines qui se caractérise par un profil de résistance croisée spécifique. ABCB1 exprimant différentes cellules cancéreuses ont été MDR traités par anti-ABCB1 shRNA vecteur d'expression portant E. coli. Cette procédure a abouti à l'activation des voies de l'ARNi dans les cellules cancéreuses et une réglementation considérable bas de l'ARNm de ABCB1 encodage ainsi que la pompe d'extrusion médicament correspondant. En conséquence, l'accumulation du médicament a été renforcée dans les cellules du cancer primitif résistantes aux médicaments et le phénotype MDR a été inversé. Au moyen de ce modèle les données fournissent la preuve de concept que les savoirs traditionnels ARNi est adapté à la modulation de cancer associés à des facteurs, par exemple ABCB1 dans des cellules cancéreuses humaines.

Protocol

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1) Livraison bactérienne des shRNA

  1. Avant de commencer avec la culture bactérienne, il faut se préparer milieu LB et LB-agar.
  2. Pour le milieu LB peser extrait de levure (0,5% p / v), Bacto tryptone (1,0% p / v), et du NaCl (0,6% p / v) et diluer ces composants dans de l'eau bidest. Les solutions préparées doivent être stérilisés dans un autoclave et sont alors prêtes à utiliser.
  3. Pour LB-agar gélose Bacto (1,5% p / v) doit être ajoutée à la précédente milieu LB à la stérilisation.
  4. Chauffer LB-agar dans le micro-ondes jusqu'à ce que le LB-agar soit complètement dissoute. Laisser la solution refroidir jusqu'à ce que la bouteille pe....

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Discussion

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Le nombre de cellules ensemencées pour l'infection et la MOI correspondants utilisés, dépendent essentiellement sur les lignées cellulaires sous observation et leur vitesse de croissance. Pour trouver le nombre de cellules optimales pour le semis, pré-expériences pour déterminer la vitesse de croissance sont fortement recommandées. Outre cela, IAM de différents doivent être testés en raison de la limite d'étendre à laquelle les cellules peuvent se l'invasion bactérienne sans mourir de stress. Le point optima.......

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Disclosures

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Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgements

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Les travaux ont été soutenus par des subventions non. 01GU0615 du «Bundesministerium für Forschung und Technologie (BMBF).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgarBiochrom AG214050
Amphotéricine BBiochrom AGA2612
Dulbecco’s Phosphate Tamponné Saline-PBS (10 x)Invitrogen GmbH14080048
E. coli ceq221 CequentPharmaceuticals Inc.Aucun catalogue disponible, commande directe
GentamycinBiochrom AGA2710
Pénicilline/StreptomycineInvitrogen GmbHContient 5 000 unités de pénicilline (base) et 5 000 &mu ; g de streptomycine (base)/ml en utilisant de la pénicilline G (sel de sodium) et du sulfate de streptomycine dans une solution saline à 0,85 %.
Chlorure de sodiumMerck KgaA1064060500
TryptoneDifco Laboratories211705
Extrait de levureDifco Laboratories212750

References

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  1. Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells. Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).
  2. Lage, H.

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Tags

Transkingdom RNAiBacterial DeliveryRNAi EffectorsEscherichia coliTRIP VectorInvasin LocusListeriolysin OABCB1 MDR1shRNA ExpressionDrug Accumulation

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