Évaluer la réponse stomatique à Live cellules bactériennes en utilisant l'imagerie feuilles entières

Résumé

Nous avons développé un protocole simple et reproductible pour accéder à la réponse stomatique bactéries vivantes. Cette méthode minimise blessant et la manipulation de la feuille par rapport à l'utilisation des pelures épidermiques rapportés précédemment.

Résumé

Les stomates sont des ouvertures naturelles dans l'épiderme des plantes responsables de l'échange gazeux entre l'intérieur des plantes et environnement. Ils sont formés par une paire de cellules de garde, qui sont capables de fermer les pores stomatiques en réponse à un certain nombre de facteurs externes, y compris l'intensité lumineuse, la concentration de dioxyde de carbone, et l'humidité relative (HR). Les pores des stomates est aussi la principale voie d'entrée des pathogènes dans les feuilles, une étape cruciale pour le développement de la maladie. De récentes études ont dévoilé que la fermeture du pore est efficace pour minimiser le développement de maladies bactériennes dans des plantes d'Arabidopsis, une partie intégrante de l'immunité innée des plantes. Auparavant, nous avons utilisé les peelings épiderme pour évaluer la réponse des stomates à vivre des bactéries (Melotto et al 2006.), Mais le maintien de conditions environnementales favorables pour les peelings plantes fois l'épiderme et des cellules bactériennes a été difficile. Épiderme des feuilles peut être gardé en vie et en bonne santé avec du tampon MES (10 mM de KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6,15) pour des expériences électrophysiologiques des cellules de garde. Cependant, ce buffer n'est pas appropriée pour l'obtention d'une suspension bactérienne. D'autre part, les cellules bactériennes peuvent être maintenues en vie dans l'eau qui n'est pas appropriée pour maintenir les peelings épiderme pour une longue période de temps. Quand une flotte Peel épidermiques sur l'eau, les cellules de la peau qui sont exposées à l'air sec dans les 4 heures en limitant le moment de mener l'expérience. Une méthode idéale pour évaluer l'effet d'un stimulus particulier sur les cellules de garde doit présenter un minimum d'interférence à la physiologie des stomates et à l'environnement naturel de la plante autant que possible. Nous avons donc développé une nouvelle méthode pour évaluer la réponse des stomates à vivre dans laquelle les bactéries en blessant des feuilles et la manipulation sont grandement minimisés visant à fournir un test facilement reproductible et fiable des stomates. Le protocole est basé sur la coloration des feuilles intactes avec de l'iodure de propidium (PI), l'incubation de la coloration des feuilles avec une suspension bactérienne, et l'observation des feuilles sous microscope confocal à balayage laser. Enfin, cette méthode permet l'observation de l'échantillon de feuille vivent même sur de longues périodes de temps en utilisant des conditions qui simulent étroitement les conditions naturelles dans lesquelles les plantes sont attaquées par des agents pathogènes.

Protocole

1. Culture de plantes et bactéries Préparation

1. Pour commencer cette procédure semer des graines d'Arabidopsis sur un v 01:01:01: v: v mélange de milieu de culture (terre, Redi-Plug et mélanger des semis, Sun Gro), la vermiculite fine et de perlite.
2. Cultiver les plantes dans une chambre de croissance (22 ° C, 12 heures de lumière de 100 pmol / mm ² / sec par jour et 65 ± 5% d'humidité) et de l'eau au besoin. Les plantes sont prêtes à utiliser dans 4-6 semaines quand ils ont des jeunes feuilles complètement développées avant boulonnage.
3. Deux jours avant de commencer l'expérience de préparer la culture bactérie. Streak Pseudomonas syringae du stock de glycérol sur du milieu LB modifié (10 g / L de tryptone, 5 g / L extrait de levure, 5 g / L de NaCl pH 7,0, et 1,5% de gélose) et incuber pendant 24 heures à 28 ° C. Utilisez culture fraîche pour préparer l'inoculum et commencez toujours des plaques de culture de stocks de glycérol comme des bactéries devient moins virulente après l'Afrique sub-culture.
4. Utiliser des bactéries qui poussaient sur ​​la plaque pour démarrer une culture de 10 ml de liquide de P. syringae dans un erlenmeyer de 50 ml. Incuber la culture de la nuit à 28 ° C avec une agitation vigoureuse jusqu'à ce qu'il atteigne la densité optique ou DO à 600 nm entre 0,8 et 1.
5. Mesurer la DO à 600 et récolte les cellules par centrifugation à 1360 xg pendant 10 minutes. Resuspendre les cellules dans l'eau distillée de telle sorte que la DO finale est de 0,2. Cette OD correspond à 10 ⁸ unités formant colonie (UFC) / ml. Avec les bactéries prêt, commencer à préparer les feuilles et réaliser le dosage.

2. Coloration Leaf et incubation avec des bactéries

1. Afin de colorer les feuilles d'abord préparer l'iodure de propidium 20 uM ou de la solution PI dans l'eau. 10 ml de solution est suffisante pour colorer les trois petites feuilles à la fois.
2. Récupérer les plantes de la chambre de croissance et avec une pince détache trois jeunes, entièrement développé feuilles. Plongez les feuilles entières dans la solution PI pendant 5 minutes. Ensuite, retirer les feuilles et les rincer rapidement à l'eau distillée.
3. Ensuite placer une feuille avec la surface inférieure vers le bas sur une lame de microscope. Couper la feuille avec une lame de rasoir en quatre morceaux hors de la veine mi sorte que la feuille à plat sur la diapositive.
4. Pour incuber les bactéries avec les feuilles, ajouter 300 ul de suspension bactérienne sous les morceaux de feuilles sur la diapositive. Assurez-vous que la surface inférieure de la feuille est en contact avec l'inoculum.
5. Incuber les échantillons dans les mêmes conditions environnementales qui ont été utilisées pour cultiver les plantes. Au moment d'observer les feuilles sous le microscope, le transfert des morceaux de feuilles d'une nouvelle diapositive avec surface inférieure vers le haut. Notez que lamelle n'est pas utilisé lors du montage des lames. L'échantillon même feuille peut être imagée plusieurs fois pendant l'incubation et un cours à temps peut être mis en place en fonction des objectifs de recherche.

3. Analyse au microscope, de mesure et de données

1. Voici un microscope confocal à balayage laser (LSM 510 Meta, Carl Zeiss Inc) est utilisée pour examiner les feuilles. Observez la surface inférieure des feuilles pour détecter la fluorescence du PI (excitation 453 nm, émission 543 et 620 nm).
2. En utilisant les échantillons de feuilles mêmes de capturer des images de stomates au fil du temps. Enregistrer les images pour mesurer la largeur de l'ouverture des stomates.
3. Mesurez la largeur d'ouverture des stomates d'au moins 60 stomates pour chaque traitement à chaque point de l'image en utilisant le navigateur LSM.
4. Calculer l'erreur moyenne et standard pour la largeur d'ouverture des stomates. La signification statistique des résultats peut être calculée en utilisant 2-tailed, Student apparié sages t-test.

4. Des images représentatives de réponse stomatique d'incubation avec des bactéries

1. Voici une image typique microscopiques (en utilisant un objectif 20x) d'une surface de la feuille d'Arabidopsis sous microscope confocal à balayage laser en vue champ clair (Figure 1).
2. Taches iodure de propidium la paroi cellulaire des cellules viables accroître la visibilité des cellules de garde en plus de permettre l'identification des cellules intactes pour la collecte de données (figure 2). Une gamme d'ouvertures de pores stomatiques peuvent être vus dans ces micrographies, de stomates complètement fermé à la stomates ouverts.
3. Stomates complètement fermé sont identifiés par la forme des cellules de garde (figure 3). La largeur d'ouverture est considérée comme 0 um.
4. Pour stomates ouverts (figure 4) la largeur d'ouverture affichée est mesurée en utilisant une ligne droite tracée à travers la plus vaste zone du pore stomatique.
5. Ces résultats expérimentaux sont typiques de ce dosage stomatique. Arabidopis feuilles ont été incubés dans le noir avec trois différentes souches de Pseudomonas syringae. Seule la bactérie Pst DC3000 a pu ouvrir foncé fermée stomates, telle que mesurée par la largeur d'ouverture de hasard 60 stomates par souche bactérienne (figure 5).

Figure 1. Micrographie de la surface d'une feuille d'Arabidopsis. Un champ de vision de la surface des feuilles sous microscope confocal à balayage laser (LSCM) en utilisant l'objectif 20x. Notez que l'ouverture des stomates n'est pas aussi évidente par rapport à la vue fluorescentes aidé par coloration iodure de propidium (figure 2).

Figure 2. Micrographie de la surface d'une feuille d'Arabidopsis iodure de propidium teinté. Un champ de vision de la surface des feuilles sous microscope confocal à balayage laser (LSCM) en utilisant l'objectif 20x. Remarque une gamme d'ouverture des pores stomatiques. Les flèches jaunes sont pointés de fermer complètement les stomates et les flèches vertes sont pointés aux stomates ouverts.

Figure 3. Complètement stomates se ferment identifié par la forme de l'ouverture et entre les cellules de garde. La largeur d'ouverture est considérée comme 0 um.

Figure 4. Stomates ouverts montrant la largeur d'ouverture en um. Les mesures ont été prises par l'aide du navigateur LSCM basé sur une ligne droite tirée à travers la plus vaste zone du pore stomatique.

Figure 5. L'ouverture des stomates des feuilles d'Arabidopsis incubées avec trois souches de Pseudomonas syringae pv tomate:.. DC3118, DB29, et DC3000 Les plantes ont été maintenus dans l'obscurité pendant le temps de l'expérimentation. Les résultats sont présentés comme la moyenne (n = 50-70) ± erreur standard. La signification statistique a été détecté avec deux queues de Student t-test. L'expérience a été répétée trois fois avec des résultats similaires.

Discussion

Nous avons présenté une procédure simple pour mesurer l'ouverture des stomates dans les tissus foliaires intacte permettant une évaluation facile de la réponse stomatique à différents traitements.

Bien que nous ayons présenté des résultats en utilisant le système modèle Arabidopsis / Pseudomonas syringae, le dosage des feuilles intactes stomatique peut être potentiellement réalisée avec n'importe quelle combinaison de plantes bactérie. Le protocole peut être facilement modifié pour s'adapter aux exigences de croissance des autres plantes et les bactéries pathogènes. Le principe général et la procédure reste la même. En outre, cette méthode peut être bénéfique pour les chercheurs qui désirent étudier sortie fonctionnelle des cellules de garde non seulement de vivre les microbes, mais aussi à d'autres stimuli et des agents chimiques dans des conditions qui maintiennent l'environnement naturel de la feuille.

Feuilles entières peuvent être difficiles à l'image due à son épaisseur et sa topographie irrégulière. Ce problème peut être atténué par la suppression de la nervure médiane de la feuille de sorte qu'elle repose à plat sur la lame et en utilisant la microscopie confocale. Toutefois, d'autres types de microscope à fluorescence peut être utilisée pour obtenir des images haute résolution de la surface des feuilles.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4864
Tryptone	Fisher Scientific	BP1421-1
Extrait de levure	Difco Laboratories	0127-01-7
Chlorure de sodium	VWR international	7647-14-5
Agar	Bio Express	J637-2500G
Chambre de croissance végétale
Incubateur agitateur
Microscope confocal à balayage laser