Livraison de gènes au cerveau de rat postnatal par des non-ventriculaire injection Plasmide et électroporation

Résumé

Ce protocole décrit une méthode non virale de la livraison des constructions génétiques à une certaine zone du cerveau de rongeur vivant. La méthode consiste à la préparation de plasmides, de fabrication micropipette, la chirurgie néonatale chez le rat nouveau-nés, la microinjection de la construction, et In vivo Électroporation.

Résumé

Création d'animaux transgéniques est une approche standard dans l'étude de fonctions d'un gène d'intérêt in vivo. Toutefois, de nombreux KO ou des animaux transgéniques ne sont pas viables dans les cas où le gène modifié qui est exprimé ou supprimés dans l'organisme entier. Par ailleurs, une variété de mécanismes compensatoires font qu'il est souvent difficile d'interpréter les résultats. Les effets compensatoires peuvent être atténuées par le calendrier soit l'expression du gène ou de limiter la quantité de cellules transfectées.

La méthode de non-ventriculaire postnatale microinjection et électroporation in vivo permet l'administration ciblée de gènes, siRNA ou des molécules de colorant directement à une petite région d'intérêt dans le cerveau de rongeurs nouveau-né. Contrairement à la technique du ventricule injection classique, cette méthode permet la transfection de types de cellules non-migrateurs. Animaux transfectées au moyen de la méthode décrite ici peut être utilisé, par exemple, pour deux photons en imagerie in vivo ou dans des expériences électrophysiologiques sur tranches de cerveau aigu.

Protocole

1. Présentation

Création d'animaux transgéniques est une méthode puissante d'investigation des fonctions des gènes chez les animaux vivants et pour ^une maladie de mécanisme de démêler ^2,3 ainsi que pour la manipulation des propriétés des cellules ^4. Toutefois, la procédure est assez laborieuse, extrêmement longue et coûteuse, ce qui justifie l'utilisation de méthodes alternatives de livraison de gènes viraux tels que l'injection ^5, injection ventriculaire néonatale avec électroporation in utero ⁶ et ^7,8 électroporation. La méthode de non-ventriculaire postnatale inje....

Discussion

Les méthodes de livraison de gènes dans le cerveau de rongeurs vivants sont bien établies pour l'électroporation in utero ^7,8,11,12 et, plus récemment, par électroporation postnatale ^6. Cependant, ces méthodes sont basées sur l'injection intraventriculaire de l'ADN plasmidique, qui peut être limitant pour plusieurs applications. Par exemple, ces méthodes ne permettent pas de cibler des cellules dans certaines régions du cerveau telles que l'hippocampe, ni la transfection de.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pinces à épiler 2A-sa, 115 mm	équipement	XYtronic	XY-2A-SA	Traiter avec de l'éthanol à 70 % pour désinfection avant utilisation lors d'interventions chirurgicales
Contrôleur de température biologique avec plaque chauffante en acier inoxydable	équipement	Supertech	TMP-5b
Tube en borosilicate avec filament	matériau	Sutter Instrument Co.	BF120-69-10	Aiguille en verre
Forets jetables	matériau	Meisinger	HP 310 104 001 001 008
PBS Dulbeco’s 10X	réactif	Sigma-Aldrich	D1408
Pinces Dumont n°5, 110 mm	équipement	Fine Science Tools	91150-20	Traiter avec de l'éthanol à 70 % pour désinfection avant utilisation lors d'interventions chirurgicales
Tireuse d'électrodes micr–lectrode Ealing	équipement	Ealing	50-2013	Tireuse verticale d'électrodes en verre
Éthilon, polyamide monofil 6-0 FS-3 16 mm 3/8c	matériau	Johnson & Johnson	EH7177H	Fils chirurgicaux
Seringue micro-exacte Exmire 10,0 ml	équipement	Exmire	MS*GLLX00	Seringue étanche aux gaz
Vert rapide	réactif	Sigma-Aldrich	F7252
Électrodes en forme de pince	équipement	BEX	LF650P3	Traiter avec de l'éthanol à 70 % pour désinfection avant utilisation
Contrôleur de foret Foredom	équipement	Foredom	FM3545	Alimentation électrique et commande pour foret chirurgical. L'analogue actuellement disponible est le kit micromoteur K.1070 (Foredom)
Micro-moteur à main Foredom	équipement	Foredom	MH-145	L'analogue actuellement disponible est le kit micromoteur K.1070 (Foredom)
Plateforme d'anesthésie gazeuse pour souris	équipement	Stoelting Co.	50264	Montée sur un instrument stéréotaxique
Isoflurane	réactif	Baxter Internationl Inc.	FDG9623
Pinces de pansement microchirurgicales, 105 mm	équipement	Aesculap	BD302R	Traiter avec de l'éthanol à 70 % pour désinfection avant utilisation lors d'interventions chirurgicales
Microfil	matériau	World Precision Instruments, Inc.	MF34G-5	Capillaires de remplissage de microseringue
Huile minérale	réactif	Sigma-Aldrich	M8410
Seringue NanoFil, 10 microlitres	équipement	World Precision Instruments, Inc.	NANOFIL	Seringue Hamilton
plasmide CAG-EGFP	réactif			Extrait et purifié avec le kit EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) et dissous dans de l'eau sans nucléase à une concentration de 1,5 mg/ml
Générateur d'impulsions CUY21Vivo-SQ	équipement	BEX	CUY21Vivo-SQ
Gel d'électrode Schiller	réactif	Schiller AG	2.158000	Gel conducteur
Instrument stéréotaxique pour petits animaux	équipement	David Kopf Instruments	900
Adaptateur St–lting pour souris et rat nouveau-né	équipement	Stoelting Co.	51625	Monté sur un instrument stéréotaxique. Traiter les barres auriculaires avec de l'éthanol à 70 % pour désinfection avant utilisation lors d'interventions chirurgicales
Ciseaux à iris d'étudiant, droits, 11,5 cm	équipement	Fine Science Tools	91460-11	Traiter avec de l'éthanol à 70 % pour désinfection avant utilisation lors d'interventions chirurgicales
Compresse absorbante Sugi 17 x 8 mm	matériau	Kettenbach	31602	Tampons chirurgicaux
Pompe microsérique UMP3 et contrôleur de pompe microsérique Micro 4	équipement	World Precision Instruments, Inc.	UMP3-1	Microinjecteur et contrôleur
Unité d'anesthésie Univentor 400	équipement	Univentor	8323001