Préparation des cultures de neurones d'embryons de drosophile Midgastrula scène

Résumé

Cette vidéo montre la préparation de cultures primaires de neurones d'embryons de drosophile midgastrula scène. Vues des cultures vivantes montrent les cellules 1 heure après le placage et les neurones différenciés après 2 jours de croissance dans un milieu à base de bicarbonate défini. Les neurones sont électriquement excitables et forment des connexions synaptiques.

Résumé

Cette vidéo illustre la procédure de mise cultures neuronales primaires d'embryons de drosophile midgastrula scène. Les méthodes de collecte des embryons et leur dechorionation utilisant l'eau de Javel sont démontrés. Aide d'une pipette en verre attaché à un tube d'aspiration bouche, nous illustrons l'élimination de toutes les cellules issues d'embryons unique. La méthode pour disperser les cellules d'embryons de chaque dans un petit (5 l) goutte de milieu sur une lamelle de verre sans revêtement est démontrée. Une vue à travers le microscope à 1 heure après le placage illustre la densité de cellule préférée. La plupart des cellules qui survivent lorsqu'elles sont cultivées en milieu défini sont neuroblastes qui divisent une ou plusieurs fois dans la culture avant d'étendre les processus neuritique par 12-24 heures. Une vue à travers le microscope illustre le niveau de la croissance des neurites et la ramification attendus dans une culture saine à 2 jours in vitro. Les cultures sont cultivées dans un milieu à base de bicarbonate de simples définis, dans un 5% de CO ₂ incubateur à 22-24 ° C. Processus neuritiques continuer à élaborer au cours de la première semaine de la culture et quand ils entrent en contact avec des neurites des cellules voisines, ils forment souvent des connexions synaptiques fonctionnelles. Les neurones de ces cultures d'exprimer voltage-dépendants sodium, le calcium, et les canaux potassiques et sont électriquement excitables. Ce système de culture est utile pour étudier moléculaires des facteurs génétiques et environnementaux qui régulent la différenciation neuronale, excitabilité et la formation des synapses / fonction.

Protocole

Collection I. embryon de drosophile

1. Préparer les plaques collecte des œufs
   1. Faire bouillir 200 ml dH ₂ O avec 8 g d'agar
   2. Laisser refroidir à 50 ° C
   3. Ajouter 2 ml de EtOH et 2 ml d'acide acétique
   4. Verser dans des boîtes de 35 mm de Petri en plastique, dessus
   5. Refroidir et conserver dans contenant hermétique à 4 ° C
   6. Donne environ 80 plaques
2. Préparer la pâte de levure
   1. Dissoudre la levure active Fleishmans de cuisson dans de l'eau pour former une pâte
   2. Micro-ondes pendant 20-30 secondes pour tuer la levure (attention aux bouillante sur)
   3. ....

Discussion

Dans les cultures préparées à partir de la drosophile embryons au stade midgastrula les neurones proviennent de précurseurs neuroblastes, dont beaucoup divisent avant de différenciation in vitro. Ce système offre donc une occasion unique d'étudier les facteurs génétiques et environnementaux importants dans des phases très précoces du développement neuronal (Rohrbaugh et al., 2003). Nous avons montré que les neurones cultivés dans un milieu simple défini différencier en neurones électriquement excitables qui a également une forme fonctio.......

Matériaux

Les cultures faites dans ce média doit être maintenu dans un incubateur à 5% de CO2 à environ 22-24 ° C. Nous utilisons une culture de tissus de mammifères standards incubateur placé dans une chambre froide et chauffée à 23 ° C. Toujours utilisé autoclavé eau filtrée et de faire dans des conteneurs qui sont réservées pour les médias et les suppléments seulement. Ne placez jamais un pH-mètre ou le barreau d'agitation utilisé à d'autres fins dans les médias.