Colon ascendens stent péritonite (CASP) - un modèle standardisé pour sepsis abdominal polymicrobienne

Résumé

Le Colon ascendens stent péritonite (CASP) est un modèle très standardisé pour le sepsis abdominaux polymicrobiennes chez les rongeurs. Cet article décrit la procédure chirurgicale de l'ACPS. Le modèle du PCRS et ses variantes permettent l'investigation systématique des différents problèmes concernant le sujet de la septicémie.

Résumé

Sepsis demeure un problème persistant sur les unités de soins intensifs du monde entier. Comprendre les mécanismes complexes de la septicémie est la condition préalable pour l'établissement de nouvelles approches thérapeutiques dans ce domaine. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires qui sont capables d'imiter au mieux la maladie humaine et aussi suffisamment face aux questions scientifiques. Le Colon ascendens stent péritonite (CASP) est un modèle très standardisé pour le sepsis abdominaux polymicrobiennes chez les rongeurs. Dans ce modèle, un stent petite est chirurgicalement inséré dans le côlon ascendant des souris ou des rats conduit à une fuite continue des bactéries intestinales dans la cavité péritonéale. La procédure aboutit à une péritonite, bactériémie systémique, infection d'organes par les bactéries intestinales, et la libération systémique, mais aussi locaux de plusieurs cytokines pro-et anti-inflammatoires. La létalité des ACPS peuvent être contrôlés par le diamètre du stent inséré. Une variante de ce modèle, le CASP dits avec une intervention (Caspi), soulève la possibilité de retirer le foyer septique par une deuxième opération selon les procédures habituelles en pratique clinique. CASP est un modèle facilement apprenables et hautement reproductible qui imite étroitement l'évolution clinique de sepsis abdominal. Elle conduit ainsi à l'étude sur des questions scientifiques dans plusieurs domaines de l'immunologie, par exemple, l'infectiologie, ou la chirurgie.

Protocole

1. Préparation de la souris

1. Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale du fluide de stupéfiants (voir tableau des réactifs) et la placer en position couchée.
2. Les pieds de la souris doivent être fixés avec du ruban adhésif sur la plaque pour assurer une position stable de l'animal pendant l'opération.

2. Fonctionnement

1. Prenez une canule iv, qui est couramment utilisé pour les injections iv chez les humains, et tailler sa tube plastique circulaire de 2mm à son extrémité. Nous utilisons trois différentes tailles de canules de contrôler les taux de mortalité (BD Venflon 18GA (1,2 x45mm, 80 mL / min); 16GA (1,7 x45mm, 180 mL / min) 14GA (2,0 x45mm, 270 mL / min)).
2. Après la désinfection complète de la peau abdominale, l'inciser le long de sa ligne médiane environ 15mm. Ouvrez la caverne péritonéale en incisant les muscles abdominaux et le péritoine le long de la ligne blanche.
3. Identifier le pôle caecal et tirez soigneusement le caecum, l'iléon terminal et le côlon ascendant hors de l'abdomen par l'utilisation de tampons de coton.
4. 15mm distale de la valvule iléo-colique, il faut percer la paroi du côlon ascendant avec une suture 7 / 0. Ainsi, les lésions des vaisseaux intestins doivent être évités. La suture est fixée sur la paroi colique par deux noeuds chirurgicales.
5. Maintenant perforation du côlon ascendant avec le prêt canule de 1-2 mm de la suture proximale 7 / 0. Insérez soigneusement la canule dans le colon jusqu'au sillon dans le tube de plastique est au niveau de la séreuse.
6. Mettez les extrémités libres de la suture 7 / 0 autour de la canule et le lieu d'un nœud double exactement dans le sillon préparé du tube en plastique.
7. Maintenant, prenez l'aiguille de la suture 7 / 0 et de piquer à travers la paroi du côlon antimésentérique. Consécutivement, deux nœuds chirurgicaux doivent être effectués pour de plus fixer le tube de plastique dans la paroi colique. Couper les extrémités de suture.
8. Récupérez la pièce en fer de la canule un peu et couper le tube en plastique hors proches (1mm) à la fixation 7 / 0 suture.
9. Maintenant, on doit soigneusement le lait selles du cæcum vers le stent du côlon par l'utilisation de tampons de coton jusqu'à ce qu'un petit bout de selles apparaît en haut de l'endoprothèse.
10. Mettez l'intestin retour dans la caverne et la réanimation liquidienne péritonéale Performe par l'administration intrapéritonéale de 0,5 ml de solution saline.
11. Fermer le péritoine avec une suture continue (4 / 0).
12. Fermer la peau avec des sutures singulier (4 / 0).

3. Soins postopératoires

1. Mettre le dos de l'animal dans sa cage, qui devrait contenir suffisamment de nourriture et d'eau. Pour l'analgésie, l'administration intrapéritonéale d'une substance puissante analgésique (nous utilisons la buprénorphine) devraient être régulièrement effectués.
2. Dans les deux premiers jours après l'opération, on a à contrôler les animaux toutes les 6 heures.

4. Sham CASP

1. Effectuez les étapes 1.1 à 2.4.
2. Ne pas perforer le côlon. Juste exécuter les étapes 2.6 à 2.8.
3. Effectuez les étapes 02.10 à 03.02.

5. CASPI

1. Effectuer CASP en utilisant une canule étapes suivantes 14G 01/01 au 03/01
2. 5h après l'ACPS, on doit utiliser l'animal à nouveau. Préparer et anesthésier la souris à nouveau selon les étapes 1.1 à 1.2
3. Ouvrez les sutures de la paroi abdominale.
4. Tirez sur le côlon ascendant avec le stent.
5. Découpez soigneusement les sutures de fixation du stent et retirer le stent.
6. Fermer le défaut dans le côlon avec une seule suture inversion (7 / 0).
7. Mettez de l'intestin dans la cavité abdominale et rincer ce dernier à deux reprises avec 10 ml de solution saline.
8. Fermer le péritoine avec une suture continue (4 / 0).
9. Fermer la peau avec des sutures singulier (4 / 0).
10. Suivez les étapes 3.1 à 3.2

6. Les résultats représentatifs

Dans quelques heures après l'opération, les animaux montrent des signes cliniques d'une septicémie début. Les symptômes typiques de la maladie sont à mobilité réduite, manteau horrent, sueurs, diminution de l'apport alimentaire, la perte de poids et de comportement escapade également réduite. Animaux développer une péritonite aiguë avec infection systémique consécutive normalement meurent dans les 48h. Selon la taille inséré un stent, les taux de mortalité distinctes peuvent être générés. Un des résultats 14G stent dans 100% de mortalité, de mortalité 16G donne 70%, et les taux de mortalité de 50% peut être atteint en utilisant un stent 18G (figure 1a). Les résultats de l'opération Sham dans un taux de survie de 100%. Habituellement, tous les animaux meurent inbetween les premières 48 heures après l'ACPS. Ainsi, tous les animaux qui sont en vie à ce point le temps peut être considéré comme des survivants. Cependant, nous recommandons une période d'observation supplémentaire d'au moins 72 heures pour détecter les rares «décès tardifs" après l'ACPS.

Le résultat de CASPI dépend de la période de temps après CASP lorsque le stent est enlevé. Une intervention 3h après les résultats du PCRS dans un taux de survie de 45%. Si le stent est retiré après 5h du PCRS, seulement 10% desanimaux survivent à la procédure. Un déménagement stent après les résultats 9h dans une mortalité de 100% (figure 1b). Sham CASPI conduit à 100% de survie. Pour les réglages Caspi, nous recommandons une période d'observation de 10 jours, car il ya habituellement des animaux, qui meurent plus tard 48 heures après l'ACPS.

L'inspection macroscopique de l'abdomen situs 24 heures après l'ACPS montre des signes typiques d'une péritonite: oedème, vasodilatation, la paroi intestinale érythémateux, démarcation nette des plaques de Peyer, paralysie intestinale, liquide libre, et la sécrétion septique (figure 2).

L'infection systémique peut être démontré par des analyses bactériologiques. 12 heures après l'ACPS, massives quantités bactérienne peut être détectée dans le lavage péritonéal, du sang, du foie, du poumon, la rate et les reins. L'analyse qualitative des bactéries révèle une infection systémique par les bactéries intestinales typiques comme E. coli, Bacteroides espèces, Enterococcus, etc (figure 3).

CASP-induite septicémie se manifeste dans la libération locale et aussi systémique de cytokines pro-et anti-inflammatoires et des chimiokines. 12 heures suivant l'ACPS, des quantités importantes de TNF, IL-1β, IL-6, IL-10, MCP-1 et d'autres peut être mesurée par ELISA dans le sang mais aussi dans les surnageants des suspensions d'organes, le foie, par exemple, des poumons, la rate, des reins (Fig 4).

Lors de l'établissement du PCRS dans votre laboratoire, les taux de survie, la bactériologie et la libération de cytokines devraient être prises comme des paramètres de contrôle pour une exécution correcte de l'ACPS. Plus tard, ces paramètres peuvent être pris comme la norme lu système pour tous les paramètres expérimentaux.

Figure 1a: Survie après CASP. Les taux de survie après une chirurgie CASP dépendra du diamètre du stent inséré. 14G résultats CASP un taux de mortalité de 100%, les résultats CASP 16G de la mortalité de 70%, et CASP 18G conduit à une mortalité de 50%. Sham CASP est associée à une survie de 100%. . n = 20/groupe B: Les taux de survie après une chirurgie CASPI dépendent du moment de l'enlèvement du stent. L'enlèvement du stent à 3h après 14G CASP conduit à un taux de mortalité de 55%. L'enlèvement du stent à 5h après les résultats 14G CASP un taux de mortalité de 90% tandis que l'élimination du stent à 9h, après des résultats CASP 14G à 100% de mortalité. Sham Caspi (5h) se traduit par une survie de 100%. n = 10/groupe (Sham CASPI; CASPI 9h), n = 20/groupe (3h CASPI; 5h CASPI).

Figure 2: abdominale 24h situs après CASP. La paroi abdominale a été retirée après 24h 16G CASP CASP ou fictive, respectivement. Le situs du simulacre de la souris ressemble exploité physiologiques. En revanche, les résultats du PCRS dans l'oedème, l'hyperémie, les intestins dilatated, et la démarcation des plaques de Peyer démontrant une péritonite aiguë.

Figure 3: Bactériologie. CASP conduit à une infection grave de plusieurs compartiments et des organes par les bactéries intestinales dans les 12h après l'opération. Nombre de bactéries sont donnés comme des unités formant colonie (UFC) par ml, respectivement. Les cultures bactériennes prélevées sur des souris une opération fictive sont complètement stériles (non représentée). 16G CASP, n = 5/groupe.

Figure 4: Les cytokines. CASP déclenche une réponse immunitaire systémique que plusieurs cytokines et chimiokines sont détectables dans le plasma et aussi dans les surnageants d'organes. La figure montre de manière exemplaire les cytokines pro-inflammatoires du facteur de nécrose tumorale (TNF) et l'interleukine-6 ​​(IL-6) ainsi que la prédominance des anti-inflammatoires IL-10. 12h après l'ACPS, des niveaux remarquables peuvent être détectés dans le plasma, le foie, les poumons et la rate. Cependant, l'IL-10 ne peuvent pas être détectées dans les poumons et la rate après l'ACPS. Opération fictive ne conduit pas à une sécrétion de cytokines (non représentée). 16G CASP, n = 5/groupe.

Discussion

CASP est un modèle de septicémie polymicrobienne abdominale qui répond à la plupart des critères postulé pour un modèle de septicémie précieux: CASP peut être effectué chez les petits animaux, est hautement reproductible, facile à suivre par les paramètres standard, offre de bonnes possibilités de lecture, et imite étroitement les paramètres cliniques de septicémie abdominale. Dans une étude comparative nous avons pu montrer que les CASP conduit à une péritonite diffuse avec une infection précoce et constante augmentation et l'inflammation systémique (syndrome de réponse inflammatoire systémique), tandis que la ligature et ponction du caecum (CLP) révèle un modèle de formation d'abcès intra-abdominal avec soutenue et mineures des signes d'inflammation systémique (1). La technique de CASPI présente une possibilité de simuler l'évolution clinique de péritonite avec l'accent d'assainissement consécutives chirurgicale, qui est le principe le plus important thérapeutique chez l'homme. L'ACPS peut être appliquée pour toutes les questions autour d'une septicémie ou une péritonite et est donc utile pour toutes les disciplines traitant de la recherche septicémie, par exemple en immunologie, pharmacologie, chirurgie, médecine de soins intensifs, etc Une sélection de publications portant sur des sujets différents de la septicémie en utilisant le modèle du PCRS est donnée ci-dessous (1-14).

Lorsque commençant par l'ACPS, il faut être conscient que certaines pratiques est nécessaire pour effectuer l'opération exactement et rapidement. Expérience chirurgicale peut être utile mais n'est pas requise. Nous vous recommandons de détection de letality comme un paramètre pour une exécution correcte de l'ACPS. On devrait commencer par l'ACPS 14G comme un stent grande est plus facile à manipuler qu'un plus mince. Un chirurgien CASP formé est capable d'opérer une souris dans les 10 minutes. Avant de commencer toute expérience, vous devriez vous assurer que vous êtes à proximité de cette période. Lorsque vous acquis une certaine expérience avec la procédure chirurgicale, vous devez effectuer une cinétique de survie pour vérifier vos compétences. 14G CASP devrait entraîner une létalité de 100%. Débutants dans notre laboratoire ont à prouver qu'ils sont capables de générer une létalité de 100% avec CASP 14G avant qu'ils ne commencent avec l'expérience. De plus, la bactériologie et les mesures de cytokines devraient être effectués pour vérifier la septicémie. Si vous avez des problèmes au début avec les étapes de microchirurgie de l'ACPS, l'utilisation de loupes ou d'un microscope chirurgical peut être utile. Mais en principe, l'ACPS peut être bien fait sans ces utilitaires. Pour la reproduction de nos taux de survie, il est absolument nécessaire que les mêmes matériaux, notamment les stents (BD Venflon, voir ci-dessous), sont utilisés. Sinon, des variations importantes des résultats sont possibles. De plus, nous suggérons qu'il peut y avoir des variations des résultats selon, par exemple, l'individualité du chirurgien. Toutefois, l'influence de facteurs tels que devrait être faible.

En résumé, l'ACPS est une pratique, le modèle septicémie simple, reproductible et précieux qui imite de près la situation clinique de sepsis abdominal. Il est donc adapté à tous les domaines de la recherche septicémie.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fluide narcotique			Mélanger 0,5 mL de Rompun avec 4,0 mL de Ketanest, puis ajouter 5,5 mL de solution saline (0,9 %). Pour une anesthésie complète, injecter 10 μL/g de poids corporel par voie intrapéritonéale
Rompun (20 mg/mL de xylazine)	Bayer AG
Ketanest (25 mg/mL d'éskétamine)	Pfizer Pharma GmbH	647028001E
BD Venflon 18GA (1,2x45 mm, 80 mL/min)	BD Biosciences	391457
BD Venflon 16GA (1,7x45 mm, 180 mL/min)	BD Biosciences	391455
BD Venflon 14GA (2,0x45 mm, 270 mL/min)	BD Biosciences	391456
Catgut Polyester 4/0 blanc, non résorbable	Catgut GmbH	17218113
Mariderm noir 7/0, non résorbable	Catgut GmbH	18104900