Culture organotypique d'exprimant la GFP embryons de souris pour les images en temps réel d'excroissance des nerfs périphériques

Partie 1: Préparation pour le tranchage et la culture.

1. Préparer de 10 cm des plaques de culture tissulaire avec le tranchage (DMEM, 25% 1x HBSS, 25% de sérum de veau fœtal, 0,5% de glucose, 1 mM de glutamine, 2,5 mM d'HEPES, pH 7,3) et de 3 cm Millicell-CM de 0,4 um de la culture inserts membrane et garder à l'étuve à 37 ° C et 5% de CO _2.
2. Chauffer jusqu'à 4% d'agarose à faible point de fusion dans du PBS dans le micro-ondes et le garder sur la plaque chauffante de sorte qu'il reste à environ 37 ° C.
3. Remplir de 10 cm bactériologiques des boîtes de Petri avec du PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1.8mm KH ₂ PO ₄₎ et placer sur la glace.
4. Mettre en place des dispositif de refroidissement microtome ou veiller à ce plateau de tampon et de refroidissement des éléments sont stockés dans le congélateur pour pré-refroidir.

Partie 2: intégration de l'embryon.

1. Disséquer embryons dans l'utérus et les examiner avec un microscope inversé fluorescentes pour vérifier expression de la GFP.
2. Embryons Placer sur une assiette inversée de 10 cm de Petri et les orienter en utilisant des bandes de papier Whatman pour enlever excessive PBS.
3. Appliquer agarose sur l'embryon pour le fixer dans cette position. Laissez-agarose solidifier.
4. Limite de la zone entourant l'embryon en le coupant avec une lame de rasoir.
5. Tournez l'embryon embarqué sur son autre côté.
6. Appliquer supplémentaires agarose sur des tissus embryonnaires afin de s'assurer que l'embryon est complètement noyé.
7. Préparer bloc d'agarose avec des bords nets et monter sur vibratome Chuck utilisant Loctite 406, une colle spéciale similaires à "Krazy Glue".

Partie 3: Trancheuse procédure.

1. Mettre en place le plateau de tampon prérefroidi et l'élément de refroidissement.
2. Insérer le mandrin avec le tissu collé et ajoutez 1x HBSS (Ca ^{2 +-Mg 2 +} sans HBSS, 10 mM HEPES pH du tampon 7,3, à 500 U / ml de pénicilline / streptomycine) jusqu'à couverts.
3. Insérer et fixer une lame de microtome préalablement nettoyées (70% éthanol).
4. Préparer 350 à 450 um tranches et le transfert de les utiliser raccourcie en verre Pipettes Pasteur en plaques de culture de tissus conservés sur la glace.
5. En utilisant une paire de pinces, enlevez soigneusement agarose de chaque tranche et transfert à Millicell membranes culture. Environ 4 tranches peuvent être cultivées sur une membrane dans une plaque de 10 cm de culture de tissu rempli de 6 mL de milieu de culture.
6. Incuber les tranches à 37 ° C et 5% de CO ₂ (milieu de culture: DMEM, 25% 1x HBSS, 25% sérum de veau fœtal, 0,5% de glucose, 1 mM de glutamine, 2,5 mM d'HEPES, pH 7,3). Si on effectue imagerie time-lapse séries on devrait garder le volume de la constante de moyenne. Dans le cas de l'imagerie chronométré série pour un court laps de temps, il suffit de laisser le milieu tel qu'il est. Pour les périodes de culture plus des changements après 12-20 heures est recommandé.

Partie 4: prolongement d'imagerie du nerf spinal au microscope.

1. Nerfs spinaux image plaçant une plaque de 10 cm de culture de tissus, contenant des membranes de la culture avec des tranches de Millicell, sous un microscope droit fluorescentes.
2. Etiquette de l'orientation des membranes de la culture Millicell sur scène microscope pour positionner correctement le point lors de l'imagerie en temps prochain.
3. Prolongement du nerf rachidien à l'aide d'images 4x (ouverture numérique [NA] 0,1), 10x (NA 0,3) ou 20x (NA 0,5) objectifs.

La figure 1 montre une série d'imagerie dépeignant l'excroissance du nerf spinal pendant 20 heures de culture avec des objectifs 4x et 10x.

Figure 1 série d'imagerie d'excroissance du nerf spinal dans une tranche transversale d'un embryon homozygote tauGPF. * = Motoneurones de la moelle épinière ventrale, flèche = DRG. La dorsale (D)-ventral (V) l'axe de la tranche est indiquée. Barres d'échelle: 200 um.

In an extensive comparison of methods to prepare embryonic slice cultures of mid-gestation mouse embryos (E10 - E12), we have observed that a vibratome produces without question the most reliable results with respect to both the overall viability of the cultures and the reproducibility of the nerve outgrowth patterns. In contrast, slices prepared using a McIlwain tissue chopper³ proved to be completely inviable. We originally employed a guillotine method⁴, in which an entire litter of embryos could be simultaneously prepared by slicing with tungsten wires wrapped serially around a cutting grate to produce 400-μm sections¹. Although this technique had the advantage of speed of preparation, it yielded at most one viable section per embryo and showed a large amount of variability in outgrowth parameters. For these reasons, we feel that a vibratome-based method is the superior choice despite the longer time in preparation. Although this solution by necessity requires a vibratome, the results are vastly superior to what has been achieved through other "low-tech" approaches, and thus justifies the investment.