Méthode fiable pour très efficace In vitro Expression et ultérieures enregistrement électrophysiologique de recombinaison canaux ioniques voltage-dépendants dans des cultures de cellules rénales embryonnaires humaines (HEK-293T).
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Article de méthode
Stratégie de transfection optimisés pour l'expression et l'enregistrement électrophysiologique des recombinants canaux ioniques voltage-dépendants présents au HEK-293T
Dans cet article
Résumé
Résumé
L'expression in vitro et l'enregistrement électrophysiologique de recombinaison canaux ioniques voltage-dépendants dans des cultures de cellules rénales embryonnaires humaines (HEK-293T) est une stratégie de recherche omniprésent. HEK-293T doivent être plaqués sur des lamelles de verre à densité assez faible de sorte qu'ils ne sont pas en contact les uns avec les autres afin de permettre l'enregistrement électrophysiologique sans effets confondants dus au contact avec les cellules adjacentes. Transfectées canaux doivent aussi exprimer avec une grande efficacité à la membrane plasmique des cellules entières d'enregistrement patch clamp des courants détectable au-dessus des niveaux de bruit. Canaux ioniques hétérologue exigent souvent longues périodes d'incubation à 28 ° C après transfection afin de parvenir à l'expression membranaire adéquat, mais il ya augmentation des pertes de cellules lamelle d'adhérence et stabilité de la membrane à cette température. Pour contourner ce problème, nous avons développé une stratégie optimisée pour transfecter et la plaque HEK-293T. Cette méthode nécessite que les cellules transfectées soit à un confluence relativement élevés, et incubés à 28 ° C pendant différentes périodes d'incubation post-transfection pour permettre l'expression d'ions suffisamment de protéines canal. Les cellules transfectées sont ensuite étalées sur des lamelles de verre et incubées à 37 ° C pendant plusieurs heures, ce qui permet la fixation des cellules rigides pour les lamelles et la restabilisation membrane. Les cellules peuvent être enregistrées peu après le placage, ou peuvent être transférées à 28 ° C pour incubation. Nous constatons que l'incubation initiale à 28 ° C, après transfection, mais avant le placage, est la clé pour l'expression efficace des canaux ioniques hétérologue qui normalement n'expriment pas ainsi à la membrane plasmique. Positivement transfectées, les cellules cultivées sont identifiés par co-exprimé eGFP ou EGFP exprimée par un vecteur bicistronique (par exemple pIRES2-EGFP) contenant les ADNc recombinants canal ionique juste en amont d'un site interne d'entrée du ribosome et une séquence de codage eGFP. Cellules entières d'enregistrement patch clamp nécessite un équipement spécialisé, plus la artisanat des électrodes d'enregistrement poli et électrodes de masse en forme de L à partir de verre de borosilicate. La livraison de drogue à l'étude de la pharmacologie des canaux ioniques peuvent être obtenus directement en micropipetage médicaments dans le plat d'enregistrement, ou en utilisant microperfusion ou des systèmes à écoulement par gravité qui produisent des flux ininterrompu de solution médicamenteuse sur les cellules enregistrées.
Protocole
1. Culture de cellules
- Embryonnaires humaines de rein 293T (HEK-293T, Invitrogen) sont cultivés en monocouches adhérentes dans ventilé 25cm 2 flacons (culture de tissus traités; Cellstar; Greiner Bio-One) contenant 6 mL de milieu de Dulbecco Modified Eagles (DMEM; Sigma Aldrich) supplémenté avec 10 % v / v de sérum de veau fœtal (FBS; Sigma Aldrich), le pyruvate de sodium à 1%, et 250 pg / ml de pénicilline / streptomycine à 37 ° C avec 5% de CO 2).
Les cellules sont incubées en CO 2 incubateurs (5% de CO 2) réglé soit 37 ° C ou 28 ° C. Tous les travaux avec des cellules se fait dans une hotte ....
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Discussion
Etre capable d'enregistrer la cellule entière courants en utilisant les protocoles décrits et les solutions indique que la transfection a été un succès et que les canaux souhaités ioniques voltage-dépendants ou les complexes de canaux ioniques sont présents en quantités significatives à la membrane cellulaire. Si les cellules transfectées de façon positive (c.-vert fluorescent) mais pas les courants enregistrable, un délai supplémentaire à 28 ° C peut être nécessaire pour permettre la protéine du canal pour être convena.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par une subvention de fonctionnement découverte à partir du JDS sciences naturelles et en génie (CRSNG) du Canada, du CRSNG Alexander Graham Bell Canada Bourses d'études supérieures (doctorat) (à A. Senatore) et la Fondation des maladies du cœur, Grant -in-aid NA # 6284.
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Matériaux
| Matériau | Société | Numéro de catalogue | Commentaire |
| pIRES2-EGFP plasmidique | Clontech | 6029-1 | |
| Cercle de verre lamelles | Fisher Scientific | 12-545-80 | Cercles n ° 1 - 0.13 à 0.17mm d'épaisseur, Taille: 12mm |
| Amplificateur | Axon Instruments | Axopatch 200B ou 700B Multiclamp | |
| Système d'acquisition de données | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Logiciel d'électrophysiologie | Axon Instruments | pClamp10.1 | |
| Manipulateurs pipette | Sutter Instrument Co. | MPC-385-2 | |
| Microscope inversé à épifluorescence | Zeiss Canada | Axiovert 40 CFL | |
| Headstage | Axon Instruments | CV-7B | |
| Porte-électrode Headstage | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Détenteur de microélectrodes pour électrode de terre | Instruments de précision du monde | MEH3RF 15 | |
| Tubes capillaires électrophysiologie | Sutter Instrument Co. | BF-150-86-15 | Verre borosilicate avec filament, OD 1.5mm, OD 0.86mm, 15cm de long |
| Flaming / Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Micropipette feu polisseuse | Narishige | Micro Forge MF-830 | |
| Système de micro-perfusion de médicaments | AutoMate scientifique | SmartSquirt8 Valvelink8.2 | |
| Système de perfusion de drogues | AutoMate scientifique | Valvelink8.2 Teflon vannes |
Références
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Senatore, A., Spafford, J. D.
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Réimpressions et autorisations
