Ceci est une démonstration de la façon dont les membranes biologiques peuvent être compris en utilisant des modèles électriques. Nous démontrons également des procédures pour l'enregistrement de potentiels d'action de la chaîne nerveuse ventrale de l'écrevisse pour les laboratoires des étudiants orientés.
Article de méthode
Modélisation des membranes biologiques avec des cartes de circuits et la mesure des signaux électriques dans les axones: Exercices de laboratoire étudiant
Dans cet article
Résumé
Résumé
Ceci est une démonstration de la façon dont les modèles électriques peuvent être utilisées pour caractériser les membranes biologiques. Cet exercice introduit également la terminologie utilisée dans biophysiques électrophysiologie. Le même équipement est utilisé dans le modèle de la membrane que sur les préparatifs en direct. Certaines propriétés d'un cordon nerveux isolés sont étudiés: les potentiels d'action nerveux, le recrutement des neurones, et la réactivité de la corde nerveuse à des facteurs environnementaux.
Protocole
1. INTRODUCTION
1.1) Contexte
Une connaissance fondamentale des circuits électriques constitue un outil précieux pour comprendre et conceptualiser de nombreux aspects des expériences et théories physiologiques. Cet exercice a pour but de vous familiariser avec certains principes généraux relatifs aux sources de tension, à la résistance électrique et à la capacité électrique. Ces notions introductives fournissent les bases nécessaires à la compréhension de phénomènes tels que la transmission synaptique et la propagation des signaux électriques le long d'une fibre nerveuse.
Un avertissement s'impose : dans les circuits électriques courants composés de fils métalliques et de résistances, le COURANT est transporté par des électrons, qui possèdent une charge négative. Dans les systèmes biologiques, le courant est transporté par des IONS, qui peuvent porter une ou plusieurs charges positives ou négatives. Par convention, le courant circule du positif vers le négatif (bien que, naturellement, les électrons se déplacent en réalité en sens inverse).
Les composants du circuit représentent les propriétés électriques des tissus vivants et, dans certains cas, celles d'objets inanimés (tels que les électrodes) impliqués dans leur étude.
Pendant l'exercice, prenez des notes sur les résultats et les calculs.
1.2) Principes généraux
Les propriétés fondamentales des circuits électriques parcourus par un courant continu sont décrites par la loi d'Ohm
V = IR
Où V = tension en volts (V)
I = courant en ampères (A)
R = résistance en ohms (Ω)
Cette loi régit les potentiels observés dans les cellules nerveuses à l'aide d'électrodes. Nous démontrerons d'abord la loi d'Ohm et son application aux matériaux biologiques.
1.3) Matériaux
| Élément | Quantité |
| Plaque d'essai | 1 |
| Résistances : 330 K Ω | 1 |
| : 100 K Ω | 12 |
| : 33 K Ω | 6 |
| : 22 K Ω | 1 |
| : 10 K Ω | 6 |
| : 4.7 K Ω | 1 |
| : 2.2 K Ω | 1 |
| : 1.5 K Ω | 1 |
| : 1 K Ω | 1 |
| : 510 Ω | 1 |
| : 330 Ω | 1 |
| : 220 Ω | 1 |
| : 150 Ω | 1 |
| : 100 Ω | 1 |
| Condensateurs : 0.1 μF | 6 |
| : 10 μF | 6 |
| Fils | 12 |
| PowerLab | 1 |
| Connexions de sortie PowerLab | 1 |
| Connexions d'entrée PowerLab | 1 |
| Voltramètre (avec fonction ampèremètre) | 1 |
Clé de codage des résistances
| Couleur | Chiffre |
| Noir | 0 |
| Marron | 1 |
| Rouge | 2 |
| Orange | 3 |
| Jaune | 4 |
| Vert | 5 |
| Bleu | 6 |
| Violet | 7 |
| Gris | 8 |
| Blanc | 9 |
| Argent | Tolérance de 10 % |
| Or | Tolérance de 5 % |
1re bande - 1er chiffre
2e bande - 2e chiffre
3e bande - Nombre de zéros
4e bande - Tolérance
Figure 1 : Installation du système. Ordinateur, plaque de montage et laboratoire d'alimentation avec stimulateur de sortie.
Le système PowerLab (interface PowerLab d'AD Instruments, Australie) servira de source de tension dans cette expérience. Branchez le câble USB du PowerLab à l'ordinateur, allumez le PowerLab, puis ouvrez le programme LabChart depuis le bureau. Sélectionnez « Nouveau fichier ». Une fenêtre apparaîtra avec plusieurs canaux d'enregistrement. Sélectionnez « Configuration » en haut, puis cliquez sur « Paramètres du canal ». Dans le coin inférieur gauche de la fenêtre, réduisez le nombre de canaux à 1 ; sur le canal 1, modifiez la plage à 5 V. Connectez le câble stimulateur muni des deux embouts crochets aux ports de sortie du PowerLab : reliez le câble connecteur rouge au port de sortie positif et le câble connecteur noir au port de sortie négatif. Ensuite, il est nécessaire de modifier la puissance de sortie, la fréquence et la durée de l'impulsion du PowerLab. Pour ce faire, sélectionnez « Configuration », puis « Panneau stimulateur ». De longues impulsions de 1,5 V sont nécessaires pour la première partie de l'expérience ; réglez donc l'amplitude à 0,75 V ; cela donnera une plage de 1,5 V (le PowerLab émettra une tension variant entre +0,75 V et -0,75 V). Réglez la fréquence (0,5 Hz) et la durée de l'impulsion (1 s).
Figure 2 : Schémas du circuit sur plaque d'essai. Les bandes de couleur le long des côtés sont toutes reliées entre elles en un seul bloc pour chaque couleur. Les 2 colonnes horizontales situées au centre sont connectées entre elles sur chaque moitié, pour une rangée donnée, mais ne traversent pas la ligne médiane ni ne se relient aux bandes latérales. Chaque rangée centrale est indépendante de la rangée suivante.
Lorsque l'on utilise une plaque d'essai, deux colonnes situées de chaque côté servent aux connexions d'entrée et de sortie. L'entrée positive est généralement reliée à la colonne positive droite, dont toutes les rangées sont interconnectées. L'entrée négative est connectée au côté opposé de la plaque d'essai, où, là encore, toutes les rangées d'une colonne sont reliées entre elles. Au centre, entre les deux séries de colonnes, se trouvent plusieurs rangées de cinq cellules, chacune étant indépendante des autres. Toutes les cellules d'une même rangée de cinq sont connectées entre elles, mais isolées des autres rangées. Se référer à la Figure 2. Les zones surlignées indiquent quelles parties de la plaque d'essai sont interconnectées. Une vidéo utile sur l'utilisation de la plaque d'essai est disponible en ligne à l'adresse suivante : http://www.youtube.com/watch?v=oiqNaSPTI7w&feature=related
Exercice 1
Utilisez la loi d'Ohm pour calculer le COURANT circulant dans le circuit suivant :
Courant (Réseau 1) : ________________ A
Exercice 2
Mesurez la tension aux bornes de la résistance, la résistance du résistor et le courant circulant dans le circuit ci-dessus (réseau 1).
Figure 3 : Voltmètre Wavetek Meterman.
Reconstituez le réseau 1 sur la platine d'essai en utilisant une résistance de 1500 Ω ; l'appareil PowerLab fait office de source de tension (1,5 V). Les mesures de tension, de courant et de résistance sont effectuées à l'aide du voltmètre. Pour que le voltmètre recueille des données précises, les deux sondes, rouge et noire, doivent être en contact avec un fil nu dans le circuit. En outre, le sélecteur doit être réglé sur la tension continue (DC), dans une plage adaptée à l'échelle de chaque dispositif expérimental particulier. Pour la mesure de tension, placez les deux sondes du voltmètre aux deux extrémités de la résistance. Lorsque vous mesurez la résistance de la résistance (et non la chute de tension), DÉBRANCHEZ la source de tension, puis placez à nouveau les deux sondes aux bornes de la résistance. Pour mesurer le courant, le voltmètre doit être branché en SÉRIE dans le circuit ; veillez à ce que les sondes rouge et noire soient correctement orientées par rapport au sens du courant.
Tension (Réseau 1) : ________________V
Résistance (Réseau 1) : ________________Ω
Courant (Réseau 1) : ________________A
Maintenant, à l'aide du Power Lab, mesurez la tension aux bornes du réseau 2 (identique au réseau 1, mais sur une platine d'essai), comme vous l'avez fait avec le voltmètre. Débranchez le voltmètre et connectez les câbles de la sonde de mesure de tension avec les pinces rouge et noire. Ensuite, utilisez le curseur pour cliquer sur « Channel 1 » (côté droit de l'écran). Cliquez puis allez dans « input amplifier ». Dans la fenêtre, cliquez sur le bouton « differential » et réglez la plage à 5 V. Cliquez sur « OK » pour enregistrer les modifications.
Cliquez sur « Démarrer » (en bas à droite) pour collecter les données. Vous pouvez arrêter à tout moment pour mesurer les déviations de tension. Pour mesurer la tension enregistrée, cliquez sur « Arrêter » et utilisez le curseur « M » (en bas à gauche) en le faisant glisser jusqu'à la ligne de base. Utilisez ensuite le curseur libre pour atteindre le sommet de la trace de tension afin de mesurer l'amplitude. Lisez la variation de tension (ΔV) et notez les données sur papier. Vous pouvez confirmer les résultats à l'aide du voltmètre autonome.
1.4) Résistance et conductance en série
Principe du diviseur de tension : La chute de tension aux bornes de l'ensemble des résistances en série est égale à la tension de la source. La tension aux bornes de chaque résistance individuelle dépend de la fraction de la résistance totale que représente cette résistance. Ainsi :
Une paire de résistances divise une tension selon le rapport de leurs résistances individuelles.
Exercice 3
Calculez la chute de tension aux bornes de chaque résistance dans le réseau 3. Vérifiez vos calculs en mesurant la tension réelle à l’aide de votre voltmètre et du logiciel Power Lab, avec la source de 1,5 V connectée.
RÉSEAU 3. Utilisez les deux résistances indiquées ci-dessus.
| Calculé : | Mesuré : |
| Tension (aux bornes de R1) : _______ V | Tension (aux bornes de R1) : ________________ V |
| Tension (aux bornes de R2) : _______ V | Tension (aux bornes de R2) : ________________ V |
1.5) Application biologique sur échantillon :
Les propriétés électriques différentes entre l'intérieur de la cellule et la solution externe d'une cellule nerveuse active fournissent un exemple de diviseur de tension. Ce circuit biologique peut être étudié à l'aide d'enregistrements effectués avec des électrodes externes. La région active de la cellule nerveuse, où les ions pénètrent, agit comme une source de tension ; le courant circule depuis cette région le long de l'intérieur de la cellule et revient par la solution externe. Ainsi, entre deux points de la membrane présentant une différence de potentiel, un courant circule, nécessairement identique à l'intérieur et à l'extérieur de la fibre ; étant donné que la résistance à l'intérieur est plus élevée que celle à l'extérieur, la chute de tension la plus importante se produit à cet endroit.
Considérons le système et son circuit équivalent (Figure 4 : A. et B.) :
Circuit équivalent :
Figure 4 : A (haut). Flux électrique du courant à travers une membrane cellulaire biologique. B (bas). Circuit électrique équivalent. La source de tension (120 mV) correspond à la tension transmembranaire générée par le potentiel d'action de la cellule nerveuse.
Remarque : R0 et Ri sont en réalité en série (et non en parallèle) en raison de la position de la source d'alimentation. Un schéma équivalent alternatif du circuit est le suivant :
Figure 5 : Circuit électrique équivalent alternatif pour la Figure 4A.
Exercice 4.
Étant donné que :
Vm, potentiel à travers la membrane = 120 mV
Ri, résistance du fluide interne = 106 Ω
R0, résistance du fluide externe = 104 Ω
Calculez V0, le potentiel entre les électrodes A et B.
V0 : ________________V
Exercice 5.
À l'aide du réseau 4 (voir ci-dessous), mesurez les potentiels aux bornes de chaque résistance (R0 et Ri).
RÉSEAU 4. Connectez des résistances de 4,7 K Ω et 10 K Ω en série avec la source de 1,5 V :
Mesurez les tensions à l'aide de votre voltmètre.
Tension (aux bornes de R0) : ________________V
Tension (aux bornes de Ri) : ________________V
RÉSEAU 5 : Identique au réseau 4, sauf que R0 = 1 K Ω
Notez que dans le réseau 5, la résistance externe est beaucoup plus faible (analogue à la présence d’un grand volume de liquide ou de tissu inactif dérivant les électrodes), d’où l’importance d’enregistrer les signaux nerveux à l’air ou sous une huile isolante, afin d’augmenter la résistance externe.
Tension (aux bornes de R0) : ________________V
Tension (aux bornes de Ri) : ________________V
1.6) Résistance et conductance en série et en parallèle
Application biologique type :
Un bon exemple de résistances en série et en parallèle est la configuration électrique d'une synapse chimique. La transmission électrique n'est pas possible à travers la plupart des synapses en raison de l'effet de court-circuit créé par l'espace synaptique. Notez toutefois que ce court-circuit est probablement nécessaire pour permettre l'établissement d'un potentiel important à travers la membrane pré-synaptique, entraînant la libération du neurotransmetteur.
Figure 6 : Modèle de flux électrochimique à travers une synapse.
Notez que dans les tissus vivants, des résistances électriques importantes se forment au niveau des membranes et dans les espaces extracellulaires restreints. Les espaces fluides relativement grands, tels que le cytoplasme cellulaire ou les solutions de bain, ne représentent pas de résistances significatives.
Exercice 6.
Le réseau 6 (voir ci-dessus et la plaque de circuit) est l'analogue d'une synapse chimique transmettant. Dans les synapses transmettant électriquement, l'intervalle synaptique (résistance de dérivation Rs) est éliminé et le courant circule directement de la cellule présynaptique à la cellule postsynaptique à travers Rm1 et Rm2, puis traverse Rm3. L'atténuation du réseau peut facilement être mesurée avec différentes valeurs de résistance, illustrant ainsi les variations dans différents types de synapses. Branchez votre PowerLab avec 1,5 V (c'est-à-dire le réglage 0,75 volt).
- Mesurez la différence de potentiel (DP) aux bornes de chaque résistance du réseau fourni, à l'aide du multimètre. Notez les valeurs des résistances. Faites une attention particulière à la DP aux bornes de Rm3 (la membrane de la cellule postsynaptique). Tension : ________________V
- Remplacez la résistance de 330 Ω située à Rs par une résistance de 330K Ω. Mesurez la DP à Rm3.
- En conservant Rs à 330K Ω, remplacez maintenant la résistance de 330K Ω située à Rm2 par une résistance de 33K Ω. Mesurez la DP aux bornes de Rm3. Tension : ________________V
- En conservant Rs à 330K Ω et Rm2 à 33K Ω, remplacez maintenant la résistance de 22K Ω située à Rm1 par une résistance de 220 Ω. Mesurez la DP aux bornes de Rm3. Tension : ________________V
Exercice 7
Un exemple de réseau résistif série-parallèle se présente lorsqu'on étudie les propriétés câblées d'une fibre nerveuse ou musculaire. La CONSTANTE DE LONGUEUR d'une fibre correspond à la distance sur laquelle une d.d.p. à travers la membrane diminue jusqu'à 37 % de sa valeur initiale. L'atténuation est due aux résistances interne et externe des fluides situés de part et d'autre de la membrane, qui sont court-circuitées par la résistance transversale de la membrane (relativement élevée). La valeur de la résistance limite la transmission d'un signal le long de l'axone d'une cellule nerveuse. La constante de longueur correspond à 1/e, mesurée selon une décroissance exponentielle. dE/dT = -E/RC ; où E est la différence de tension, R la résistance et C la capacité. Ou sous une autre forme : E = Eoexp (-t/RC) ; où Eo est la tension initiale et t le temps en secondes. RC est également appelé tau (τ), la constante de temps.
En supposant que la résistance du fluide externe soit négligeable par rapport aux résistances intracellulaire et membranaire, les propriétés résistives passives de la membrane peuvent être représentées par le circuit suivant :
Figure 7 : Traduction du réseau 7 en montage sur plaque d'essai.
Appliquez une tension à une extrémité du réseau 7 entre A et B. Utilisez un stimulateur en sélectionnant une impulsion d'une durée de 1 s, d'une amplitude de 1 V (réglée à 0,5 V) et d'une fréquence de 0,75 Hz. Connectez le voltmètre successivement à chacune des résistances « membranaires », et notez la différence de potentiel (DP) aux bornes de chaque résistance. Laissez une extrémité de la sonde du voltmètre fixe à (A-lead, rouge), tandis que l'autre sonde est déplacée successivement aux positions 1 à 5. Reportez chaque valeur sur un graphique de la DP en fonction de la « distance » par rapport à la source, les résistances membranaires étant espacées d'une unité de distance. À partir de votre graphique, déterminez la constante de longueur de ce circuit. 
Graphique de la constante de longueur du réseau 7 : ______________
L'effet d'une augmentation de la résistance transversale de la membrane, comme cela se produirait avec une gaine de myéline, ou d'une diminution de la résistance longitudinale interne de la fibre associée à un accroissement du diamètre de la fibre, est une modification de la constante de longueur. Les valeurs des résistances ne correspondent pas exactement à celles présentes dans un axone nerveux, mais sont approximativement proportionnelles. De même, la « distance unitaire » sur le modèle est considérablement agrandie par rapport à une cellule nerveuse réelle.
1.7) Capacité
Les condensateurs stockent la charge. Lorsqu'une tension est appliquée à un condensateur à travers une résistance, un courant circule vers le condensateur, et alors la d.d.p. (différence de potentiel) aux bornes du condensateur augmente exponentiellement dans le temps vers la d.d.p. de la source ; le cours temporel de ce changement de tension dépend de la tension appliquée, de la capacité et de la résistance en série. Un cours temporel similaire, mais inversé, est observé lors de la décharge d'un condensateur.
Branchez l'entrée de ce simple réseau Résistance-Condensateur (RC) à votre stimulateur, aux points A et B. Utilisez des impulsions de 1 V (réglées à 0,5 V) avec une durée de 1 s et une fréquence de 0,75 Hz. Vous devez également régler l'acquisition à 20 k/s (côté droit du panneau). Connectez vos pinces d'entrée du PowerLab aux bornes du condensateur. Enregistrez pendant quelques secondes, puis arrêtez. Utilisez la fenêtre de zoom pour agrandir le temps de montée d'une des impulsions carrées. Le zoom devra peut-être être répété plusieurs fois pour étaler le tracé. Mesurez le temps de montée depuis la ligne de base jusqu'au sommet du tracé de tension, juste au moment où il s'aplatit. Observez le cours temporel du changement de potentiel et la déformation des impulsions carrées. Observez l'effet du remplacement du condensateur de 10 μF par un condensateur de 0,1 μF. En connectant la sonde de tension du PowerLab aux bornes de la résistance, vous pouvez observer le cours temporel du courant traversant le circuit. N'enregistrez que quelques impulsions, puis arrêtez pour effectuer la mesure. Utilisez le curseur « M » pour vous placer sur la ligne de base avant la montée, et le curseur libre à l'endroit où la tension commence à s'aplatir.
Le dernier exemple implique des composants à la fois résistifs et capacitifs. Les propriétés passives de câble des fibres nerveuses et musculaires sont déterminées par des éléments similaires, issus des propriétés de la membrane cellulaire. Non seulement existe-t-il une résistance membranaire transversale dans la cellule, mais également une capacité membranaire, due aux propriétés électriques de la membrane cellulaire. L'effet de ceci est de modifier le cours temporel du développement des potentiels propagés électrotoniquement.
Exemple :
Ce réseau peut être construit à partir du réseau 7 en raccordant les condensateurs requis en parallèle avec les résistances membranaires (Rm).
Exercice 8.
Connectez les condensateurs de 10 μF au réseau 7. À l’aide d’impulsions de 1 s, 1 V (réglage à 0,5 V) et 0,75 Hz provenant du stimulateur, qui doit être connecté aux points A et B, observez les variations de potentiel aux bornes de chaque résistance membranaire. En supposant que la tension « seuil » (la tension à laquelle un potentiel d’action est généré dans une cellule nerveuse) soit de 0,2 V, mesurez le temps nécessaire pour que le potentiel atteigne le seuil à chaque résistance membranaire. Ici, le seuil désigne la valeur de potentiel à laquelle un potentiel d’action peut être généré dans une cellule vivante. Représentez graphiquement vos résultats en portant le temps en fonction de la « distance ».
Figure 8 : Transposition du réseau 9 sur un montage sur plaque d'essai.
Graphique de la Figure 8.
Simulez l'effet d'une diminution de la capacité membranaire provoquée par une augmentation de l'épaisseur de la gaine de myéline en remplaçant les condensateurs plus petits de 0,1 µF. Notez le changement du temps nécessaire pour atteindre le seuil à un résistor sélectionné. Superposez les données sur le même graphique avec les condensateurs plus grands en place.
En ce qui concerne la membrane musculaire, on peut envisager une augmentation de la capacité due à l'accroissement de la surface membranaire par les tubules transverses associés, ce qui entraîne une capacité membranaire plus élevée par rapport à celle d'un neurone. Des condensateurs plus petits peuvent servir à illustrer la diminution de la capacité résultant de l'ajout de myéline à un axone nerveux non myélinisé. Le point essentiel à retenir ici est que la capacité électrique est proportionnelle à la surface, et inversement liée à l'épaisseur de la couche diélectrique (la myéline) qui sépare les « armatures » ou surfaces de stockage du condensateur.
Les propriétés présentées sur un circuit modèle sont observées dans des préparations vivantes. Toutefois, les cellules varient quant à leurs propriétés, telles que les fuites à travers la membrane et la résistance axiale. Certaines cellules ne génèrent pas de potentiels d'action. Cependant, un potentiel d'action est produit lorsqu'un signal doit être transmis sur quelques millimètres, car les propriétés électriques passives des cellules atténuent les signaux sur cette distance. Dans la prochaine série d'expériences, l'enregistrement des potentiels d'action est illustré.
1.8) Questions pour les étudiants
- Quelles sont quelques valeurs normales de la constante de longueur pour les neurones et les cellules musculaires ?
- Que se passerait-il si une membrane avait une faible résistance membranaire : la constante de temps (temps nécessaire pour atteindre 63 % de la valeur finale) changerait-elle ? Si oui, de quelle manière changerait-elle avec une résistance membranaire plus faible ? Quelle est la formule mathématique généralisée de la constante de temps (tau) ?
- Pourquoi les axones plus gros, comme l'axone géant de calmar, peuvent-ils conduire les signaux électriques plus rapidement que les axones plus petits dans la même préparation de calmar ?
2. PROPRIÉTÉS DE CONDUCTION DES CELLULES NERVEUSES
2.1) Du circuit imprimé aux cellules vivantes
Les propriétés passives observées dans les exercices sur carte électronique sont également mesurables dans les cellules vivantes ; toutefois, ces propriétés passives peuvent être difficiles à isoler lorsqu'elles sont accompagnées de potentiels d'action dans les cellules nerveuses. Les propriétés actives du neurone correspondent à sa capacité à maintenir un potentiel de membrane au repos, à générer des potentiels d'action et à les régénérer le long d'un segment de membrane.
Le flux électrique le long d'un cordon nerveux peut également être régénératif au sein de neurones individuels et d'un neurone à l'autre. Dans le cordon nerveux ventral (VNC) de l'écrevisse, certains neurones communiquent par des jonctions septées (c'est-à-dire des jonctions gap). Comme cela a été démontré dans les exercices précédents avec la plaque d'essai, modifier la résistance peut entraver la conduction des signaux électriques. Cela équivaut à modifier le flux de courant à travers les jonctions gap dans le cordon nerveux ventral.
La vitesse de conduction et d'autres propriétés du potentiel d'action composé dans le cordon nerveux ventral (VNC) sont examinées dans la série suivante d'expériences. Nous allons démontrer comment obtenir le VNC pour l'expérimentation et comment provoquer et mesurer les réponses à l'aide d'un équipement standard conçu pour les laboratoires pédagogiques destinés aux étudiants.
2.2) Préparation du écrevisse
La corde nerveuse ventrale de l'écrevisse est la mieux adaptée à cette expérience. Le nerf est facile à disséquer, et divers protocoles pouvant influencer la conduction peuvent être utilisés avec cette préparation. Avant de commencer cette expérience, familiarisez-vous avec les termes d'anatomie de l'écrevisse indiqués ci-dessous :
Figure 9. Schéma général de l'anatomie de l'écrevisse.
Modifié à partir de : http://www.enchantedlearning.com
2.3) Notions fondamentales sur la conduction dans un nerf
La corde nerveuse ventrale de l'écrevisse assure la transmission des signaux qui déclenchent des réponses d'échappement telles que la réaction de battement de queue. Pour cette expérience, des enregistrements seront effectués sur l'ensemble de la corde nerveuse intacte. Les potentiels individuels de chaque neurone de la corde nerveuse s'additionnent pour produire un potentiel d'action composé, qui donne les impulsions électriques mesurables affichées par le logiciel d'enregistrement. Erlanger, Gasser et Bishop (1924) comptent parmi les pionniers ayant décrit les potentiels d'action composés. Les caractéristiques de la période réfractaire, de la vitesse de conduction et des effets neuronaux de l'inhibiteur des jonctions gap, le 1-heptanol, ou de la température sont présentées. L'apprentissage des principes fondamentaux des signaux des cellules nerveuses contribue à une meilleure compréhension générale du fonctionnement neurologique (Bennett, et al., 1991 ; Furshpan et al., 1959 ; Watanabe et Grundfest, 1961).
2.4) Matériaux
| Article | Quantité |
| Crevette géante (Procambarus clarkii) | 1 |
| Ciseaux de dissection de précision | 1 |
| Pince | 1 |
| Chambre à nerf MLT016/X | 1 |
| Ordinateur portable avec logiciel Scope | 1 |
| PowerLab | 1 |
| Amplificateur PowerLab | 1 |
| Câble de sortie stimulateur pour PowerLab | 1 |
| Connecteur USB PowerLab/ordinateur | 1 |
| Pied manipulateur avec électrode de succion | 1 |
| Pipette en verre avec poire | 1 |
| Bécher de solution saline pour crevette | 1 |
2.5) Méthodes
2.5.1) Dissection
Veillez à préparer la boîte à nerfs, les différents instruments et solutions avant de disséquer un écrevisse.
- Envelopper l'écrevisse dans une serviette en papier humide pour la maintenir, ou simplement tenir l'écrevisse dans une main avec les pinces (chélopodes) placées entre le pouce et l'index.
- Avec l'autre main, effectuez une incision à l'aide de ciseaux à travers le rostre entre les orbites oculaires.
- Couper vers le bas à partir de l'incision jusqu'à ce que la tête soit complètement détachée.
- Faire une incision à la base du céphalothorax au-dessus de l'abdomen ; retirer la queue. (Si nécessaire, les pinces et les pattes marcheuses peuvent être retirées pour faciliter cette opération.)
- Retirer les appendices natatoires.
- Effectuez une incision le long des deux côtés de la face ventrale de l'abdomen. Veillez à ne pas endommager les tissus profonds.
- Relever la section détachée de l'exosquelette jusqu'à la base du panache caudal afin d'exposer le cordon nerveux ventral.
- À l'aide du bord de la pince, retirer délicatement le cordon nerveux ventral par l'extrémité. Veiller à ne pas étirer ni écraser le cordon nerveux. (Toute nodosité observée sur le cordon nerveux correspond à des ganglions d'écrevisse.)
- Disposer la corde nerveuse en travers des barreaux métalliques dans la chambre à nerf. Il est impératif de maintenir la corde nerveuse ventrale humide. Pour ce faire, ajouter suffisamment de solution saline de crevette dans la chambre à nerf pour que le niveau du liquide atteigne celui des barres transversales métalliques. Ensuite, prélever à la pipette une quantité suffisante de solution saline de crevette afin que le niveau du liquide soit juste en contact avec la partie inférieure des barres.
Solution saline pour écrevisse (mM : 205 NaCl ; 5,3 KCl ; 13,5 CaCl₂)2,2H2O ; 2,45 MgCl₂2,6H2O ; 5 HEPES ajusté à un pH de 7,4 - Une fois le nerf en place, fixez le câble du stimulateur avec les deux électrodes en mini-crochets à la chambre nerveuse. Connectez l'électrode rouge positive à l'une des boucles métalliques externes située près de l'extrémité du cordon nerveux ; connectez l'électrode noire négative à la boucle métallique adjacente la plus proche encore en contact avec le cordon nerveux.
- Positionner l'électrode de succion dans le manipulateur près de l'extrémité opposée du nerf.
- Aspirez délicatement l'extrémité du cordon nerveux ventral dans l'électrode d'enregistrement.
2.5.2) Enregistrement
Une fois que l'extrémité du cordon nerveux est aspirée dans l'électrode d'enregistrement, assurez-vous que l'électrode est fixée à la sonde et que la sonde est correctement mise à la terre. Cela peut être réalisé simplement en raccordant le câble de masse à la cage de Faraday. Les fils positif et négatif de l'électrode d'aspiration doivent également être connectés aux emplacements correspondants sur la sonde. La sonde doit être reliée à l'amplificateur différentiel, qui à son tour est connecté au PowerLab.
Connectez les fils électriques de l'électrode de succion à l'étage de tête. Les fils doivent être connectés avec le rouge (positif) en haut à gauche, le vert (masse) au milieu et le noir (négatif) en bas. Cela est indiqué à la figure 10 pour l'étage de tête ci-dessous. Le fil de masse peut simplement être placé dans le bain de solution saline. Ainsi, un fil de l'électrode de succion doit être relié à l'entrée + et l'autre à l'entrée -. Il n'importe pas lequel des fils de l'électrode de succion est connecté à l'entrée + ou à l'entrée -.
Figure 10 : Entrées pour l'étage de tête
Les paramètres de l'amplificateur sont les suivants :
| COMMANDE | RÉGLAGE |
| Hautes fréquences | CC |
| Filtre réjecteur | ARRÊT |
| Basses fréquences | 20kHz |
| Compensation de capacité | Sens antihoraire |
| Molette de décalage CC fin et grossier | Sens antihoraire |
| Décalage CC (+ARRÊT) | ARRÊT |
| Molette de gain | 50 |
| Entrée (DIFF MONO GND) | DIFF |
| MODE (STIM-GATE-REC) | GATE |
| ΩTEST | ARRÊT |
Connecter le câble USB fourni à l'arrière du PowerLab et à la prise de l'ordinateur. Ouvrir le logiciel Scope sur le bureau de l'ordinateur. En haut à droite de l'écran, sélectionner « Canal 2 » et l'éteindre. Ajuster l'affichage pour que seul le Canal 1 soit visible en faisant glisser la barre située au milieu de l'écran vers le bas. Ensuite, cliquer sur l'« Amplificateur d'entrée » du canal 1 en haut à droite de l'écran. Sélectionner les éléments suivants :
| COMMANDE | RÉGLAGE |
| PLAGE | 500 mV |
| AC | COCHE |
| FAIBLE PASSAGE | ÉTEINT |
| EXTRÉMITÉ SIMPLE | COCHE |
| INVERSION | COCHE |
Ensuite, à nouveau sous « Configurer », cliquez sur « Échantillonnage ». Dans la zone intitulée « Balayage » sur l'écran qui s'affiche, sélectionnez les éléments suivants :
| CONTROL | RÉGLAGE |
| MODE | PLUSIEURS |
| ÉCHANTILLON | 100 BALAYAGES |
| SOURCE | UTILISATEUR |
| RETARD | 0 SECONDE |
Enfin, sous l'onglet « Set up », sélectionnez « Stimulator ». Cliquez sur la case pour désactiver « Isolated Stim ». Choisissez les paramètres suivants :
| CONTROL | RÉGLAGE |
| MODE | PLUSIEURS |
| RETARD | 5 ms |
| DURÉE | 1 ms |
| IMPULSION(S) | 2 |
| INTERVALLE | 15 ms |
| PLAGE | 5 V |
| AMPLITUDE | 0,5 |
Voir « Base de temps » dans le panneau de droite. Changer « Échantillon » à 1024 et « Temps » à 200 ms.
Figure 11 : Deux potentiels d'action composés avec un intervalle de 15 ms entre les stimuli, tels qu'enregistrés à l'aide du logiciel Scope.
Exercice 1.
Sélectionnez le bouton « Démarrer » situé en bas à gauche de l'écran. Étant donné les paramètres ci-dessus, un potentiel d'action composé bien défini devrait apparaître dans la fenêtre de collecte des données du Scope (Figure 11). Esquissez la forme générale du potentiel d'action sur le graphique ci-dessous (Figure 12) :
Figure 12 : Graphique vierge pour esquisser la forme du potentiel d'action composé.
Diminuez lentement la tension à l'aide de l'onglet situé en haut à gauche de l'écran. Le potentiel d'action devrait diminuer en amplitude jusqu'à ce que son profil d'onde caractéristique disparaisse également. La réduction de la tension diminue le nombre de neurones recrutés pour produire le potentiel d'action composé. Les axones de plus grand diamètre sont probablement recrutés à des tensions plus faibles et sont ceux qui conduisent plus rapidement, apparaissant ainsi en premier dans le potentiel d'action composé. Augmentez progressivement la tension pour observer l'effet inverse : à mesure que davantage de neurones sont recrutés, l'onde du potentiel d'action composé augmente en amplitude. Cet exercice illustre le fait que chaque neurone possède un seuil différent pour la génération du potentiel d'action. Lorsque le potentiel d'action composé n'augmente plus malgré une augmentation de la tension de stimulation, tous les neurones ont été recrutés ; deux pics distincts dans l'onde du potentiel d'action doivent être visibles sur l'écran de l'ordinateur.
Exercice 2.
Après avoir examiné le recrutement neuronal et le potentiel d'action composé qui en résulte, observez l'effet de la période réfractaire. Cela peut être réalisé en appliquant deux stimuli rapprochés dans le temps et en faisant varier l'intervalle interstimulus, puis en observant à quel intervalle interstimulus le potentiel d'action composé, déclenché par le second stimulus, présente une amplitude réduite par rapport au premier potentiel d'action composé. Modifiez le délai entre les impulsions à l'aide de l'onglet situé en haut à gauche de l'écran. Raccourcissez progressivement le délai jusqu'à ce que le second potentiel d'action composé ne puisse plus être déclenché. La durée entre les impulsions à laquelle un second potentiel d'action n'est plus déclenché correspond à la période réfractaire absolue. La durée comprise entre la fin de la période réfractaire absolue et le moment où un second stimulus génère un potentiel d'action d'amplitude maximale est appelée période réfractaire relative. Donnez une estimation des périodes réfractaire absolue et relative dans les espaces prévus à cet effet.
Période réfractaire absolue : ___________________
Période réfractaire relative : ___________________
2.5.3) Mesure de la vitesse de conduction
À l’aide d’une règle graduée en millimètres, mesurez la distance entre le fil stimulateur le plus proche de l’électrode d’enregistrement et l’électrode d’enregistrement elle-même. À partir de l’enregistrement obtenu, mesurez le temps correspondant aux différents pics des événements dans le potentiel composé afin de pouvoir déterminer la vitesse de conduction des différents signaux électriques. Convertissez la distance en millimètres en mètres et le temps en millisecondes en secondes pour exprimer la vitesse en mètres par seconde.
Vitesse de conduction du 1er signal : __________________
Vitesse de conduction du 2e signal : __________________
Vitesse de conduction du 3e signal : __________________
Vitesse de conduction du 4e signal : __________________
2.5.4) Manipulation des jonctions communicantes et/ou de la vitesse de conduction
Ensuite, étudiez les propriétés d'un inhibiteur neuronal. L'effet désaccoupleur de l'heptanol a été décrit pour la première fois dans les axones septés d'écrevisse (c'est-à-dire les jonctions gap) par Johnston et al. (1980). Cet effet lié à la communication électrique a rapidement été confirmé dans divers systèmes de vertébrés et d'invertébrés (Bernardini et al., 1984 ; Meda et al., 1986). Pour comprendre le rôle de la communication électrique dans cette corde nerveuse ventrale, une solution saline contenant (1 mM) de 1-heptanol peut être utilisée afin de désaccoupler les jonctions gap. À l’aide d’une pipette en verre, rincez l’ensemble de la corde nerveuse avec une solution d’heptanol. Observez le changement enregistré par le logiciel d’enregistrement Scope, puis résumez-le. (Notez la modification de la forme d’onde et si la vitesse de conduction des formes d’onde a changé.) Alternativement, au lieu d’utiliser le 1-heptanol, une solution saline glacée peut être substituée à la solution bain, et toute modification de la forme d’onde ou de la vitesse de conduction des formes d’onde peut être surveillée.
Discussion
Notre objectif dans la présentation vidéo en ligne et ce document est de démontrer que les propriétés biophysiques des cellules peuvent, en partie, être modélisée comme des circuits électriques. En outre, avec le tissu neural en direct qui est relativement facile à obtenir, les principes fondamentaux de la vitesse de conduction, les périodes réfractaires et les techniques d'enregistrement électrophysiologiques sont possibles pour les laboratoires étudiant de premier cycle avec un investissement modeste de l'équipement. Les thèmes et les paradigmes fondamentaux présentés peuvent être facilement modifiées pour les besoins de différents cours.
Entretien des écrevisses et leur abondance rend les modèles attrayants pour les étudiants-conduit l'expérimentation. Crustacés cordons nerveux ventraux sont généralement robustes et de conserver l'intégrité physiologique dans une solution saline minimale pendant des heures, ce qui est suffisant pour un laboratoire étudiant trois heures.
Étant donné que certains des axones grande dans le VNC de l'écrevisse sont connectés via des jonctions, l'expérimentation supplémentaire sur leur contribution peut être effectuée, et des propriétés différentes de celles trouvées dans la préparation du nerf sciatique de grenouille norme peut être démontrée. Le nerf sciatique est un modèle classique pour aborder les potentiels d'action composés et des propriétés de conduction. Il pourrait même être une expérience intéressante comparée aux étudiants de comparer les propriétés de conduction, le recrutement axone, et les périodes réfractaires entre ces deux préparations.
Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Ces expériences ont été modifiés à partir d'un manuel de laboratoire qui a été utilisé dans un cours, orchestrée par le Dr HL Atwood, au Département de zoologie, Université de Toronto. Les exercices ont également été utilisés et modifiés à partir d'un manuel qui a été produit pour "6 ème IBRO atelier intensif sur neurosciences fondamentales" et a eu lieu à l'Université de Corée, Séoul, Corée du Sud en 1993 (Cooper et al., 1993). Les modifications actuelles ont été nécessaires pour utiliser l'équipement commun à présenter aux étudiants des laboratoires dirigés jours dans diverses universités. Soutenue par l'Université du Kentucky, Département de biologie, Bureau des études de premier cycle et le Collège des Arts et des Sciences.
Matériaux
Circuit imprimé
- Electronics énumérés ci-dessous pour les expériences breadboard peuvent être obtenus à un magasin d'électronique comme Radio Shack.
- Planche à pain, résistances, condensateurs, batteries et les fils qui peuvent servir de jonctions pour les breadboard décrites dans les expériences.
- Un voltmètre commune (Wavetek Meterman voltmètre)
- Un conseil / D pour l'enregistrement en ligne sur un ordinateur. Les signaux électriques sont enregistrées sur la ligne à une interface PowerLab/4s (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). Nous utilisons un logiciel standard de ADInstruments nommé Chart ou la portée.
Expériences sur la physiologie
- Ecrevisses (Procambarus clarkii). Atchafalaya biologique Supply Co., Raceland, LA., USA.
- Standard écrevisses salin: modification de la solution Van Harreveld (1936). (En mm) 205 NaCl, 5,3 KCl; 13,5 CaCl 2, 2H 2 O; 2,45 MgCl 2 6H 2 O; HEPES 5 et ajusté à pH 7,4. Tous les produits chimiques salines ont été obtenus auprès de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO).
- Des outils de dissection: Beaux # 5 pinces, ciseaux fins, porte-lame de couteau, des broches # 26002-20 insectes (tous obtenus à partir des outils Fine Science (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139)
- Un plat de chambre nerveuses (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA) pour tenir le nerf. Les fils qui viennent avec le plat de chambre nerf peut être utilisé pour stimuler le nerf.
- Une électrode de succion est utilisé pour enregistrer les signaux.
- Le manipulateur ou une pince sur un support universel servira également de support à l'électrode d'aspiration.
- Cage de Faraday
- Microscope à dissection
- Illuminateur à haute intensité (source lumineuse)
- Platform Microscope
- Amplificateur différentiel AC / DC (AM Systems Inc Modèle 3000)
- PowerLab 26T (Instruments AD)
- Amplificateur extracellulaire (Instruments AD)
- LabChart 7 (DJA Instruments)
- Des outils de dissection
- Un anneau de support et pince à servir de support pour l'électrode d'enregistrement d'aspiration
Références
- Bennett, M. V. L., Barrio, L. C., Bargiello, T. A., Spray, D. C., Hertzberg, E., Sdez, J. C. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron. 6, 305-320 (1991).
- Bernardini, G., Peracchia, C., Peracchia, L. L. Reversible effects of heptanol on gap junction structure and cell-to-cell electrical coupling. European Journal of Cell Biology. 34 (2), 307-312 (1984).
- A report on the, "SIXTH INTENSIVE IBRO WORKSHOP ON BASIC NEUROSCIENCE". Cooper, R. L., Chang, J. J., Ito, M. July 1993, Seoul, South Korea, , Society for Neuroscience. 116-116 (1985).
- Cragg, B. G., Thomas, P. K. The relationship between conduction velocity and the diameter and internodal length of peripheral nerve fibers. Journal of Physiology. 136, 606-614 (1957).
- Erlanger, J. G. asser, S, H., Bishop, G. H. The compound nature of the action current of nerves as disclosed by the cathode ray oscillograph. American Journal of Physiology. 70, 624-666 (1924).
- Furshpan, E. J., Potter, D. D. Transmission at the giant motor synapses of the crayfish. Journal of Physiology. 145 (2), 289-325 (1959).
- Johnston, M. F., Simon, S. A., Ramrn, F. Interaction of anesthetics with electrical synapses. Nature (Lond). 286, 498-500 (1980).
- Loewenstein, W. R. Permeability of membrane junctions. Annual NY Academy of Sciences. 137, 441-472 (1966).
- Meda, P., Bruzzone, R., Knodel, S., Orci, L. Blockage of cell-to-cell communication within pancreatic acini is associated with increased basal release of amylase. Journal of Cell Biology. 103 (2), 475-483 (1986).
- Peracchia, C. Increase in gap junction resistance with acidification in crayfish septate axons is closely related to changes in intracellular calcium but not hydrogen ion concentration. Journal of Membrane Biology. 113 (1), 75-92 (1990).
- Peracchia, C., Dulhunty, A. F. Low resistance junctions in crayfish: structural changes with functional uncoupling. Journal of Cell Biology. 70, 419-439 (1976).
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- Wiersma, C. A. G., Hughes, G. M. On the functional anatomy of neuronal units in the abdominal cord of the crayfish, Procambarus clarkii. Journal of Comparative Neurology. 116, 209-228 (1961).
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