Nous fournissons un protocole étape par étape pour la cellule entière d'enregistrement de patch-clamp de Calcium Release-Activated calcium (CRAC) des courants dans les zones périphériques mononucléées du sang de cellules dérivées de lymphocytes T humains.
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Article de méthode
Cellules entières d'enregistrement de Calcium Release-Activated calcium (CRAC) Courants dans les lymphocytes T humains
Dans cet article
Résumé
Résumé
Dans les lymphocytes T, l'épuisement de Ca 2 + de la intracellulaire de Ca2 + magasin conduit à l'activation des plasmalemmal Ca 2 + canaux, appelés calcium Release-Activated calcium (CRAC) des canaux. Canaux CRAC jouent un rôle important dans la régulation de la prolifération des cellules T et l'expression des gènes. Anomalie de la fonction de canal CRAC dans les cellules T a été liée à une immunodéficience sévère combinée et auto-immunes 1, 2. Etudier la fonction du canal CRAC dans les lymphocytes T humains peuvent découvrir de nouveaux mécanismes moléculaires régulant les réponses immunitaires normales et de démêler les causes des maladies liées à l'humain. Enregistrements électrophysiologiques des courants membranaires fournissent l'évaluation la plus précise des propriétés fonctionnelles de canal et de leur régulation. L'évaluation électrophysiologique des courants des canaux CRAC dans les cellules T Jurkat, une ligne de la leucémie humaine des cellules T, a d'abord été effectué plus de 20 ans il ya trois, cependant, les mesures actuelles dans le CRAC lymphocytes T humains normaux reste une tâche difficile. Les difficultés dans l'enregistrement des courants de canal CRAC dans les cellules T normales sont aggravés par le fait que les dérivés du sang les lymphocytes T sont beaucoup plus petits en taille que les cellules T Jurkat et, par conséquent, les courants endogènes CRAC cellules entières sont très faibles en amplitude. Ici, nous donnons une procédure étape par étape que nous utilisent couramment pour enregistrer le Ca 2 + ou Na + courants via les canaux CRAC au repos des cellules T isolées du sang périphérique de volontaires sains. La méthode décrite ici a été adoptée par les procédures utilisées pour l'enregistrement des courants CRAC dans les cellules T Jurkat et activé des cellules T 4-8.
Protocole
1. Préparation de repos lymphocytes T humains
- Utiliser RosetteSep homme T Cocktail enrichissement cellulaire et de densité moyenne RosetteSep, purifier les cellules T à partir d'échantillons de sang humain selon les instructions du fabricant. La population cellulaire obtenue doit contenir 95% cellules T CD3 + repos. Nous purifions lymphocytes T humains à partir d'échantillons de sang périphérique prélevés sur des volontaires sains en conformité avec le protocole approuvé par le Conseil d'examen interne UC Davis.
- Après isolement, resuspendre lymphocytes T à une densité de 0,5 x 10 6 cellules / mL dans le milieu de culture cel....
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Discussion
L'exploration électrophysiologique des courants de repos CRAC lymphocytes T humains est une tâche difficile parce que le CRAC endogènes d'amplitude en cours dans ces cellules est faible en raison de la taille des cellules de petite taille (diamètre de l'reposant humaine de cellules T est dans la gamme de 5-8 um). Ici, nous présentons une procédure étape par étape pour enregistrer de manière fiable les courants de repos CRAC lymphocytes T humains isolés à partir des cellules mononucléées du sang périphérique........
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Nous sommes reconnaissants envers le Département de physiologie et biologie membranaire, Université de Californie à Davis pour nous fournir des installations et un excellent environnement pour les études des canaux ioniques.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Cocktail d'enrichissement en cellules T humaines RosetteSep | Stem Cell Technologies | 15061 | |
| Milieu de densité RosetteSep | Stem Cell Technologies | 15705 | |
| Milieu RPMI 1640 avec glutamine/HEPES | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| Sérum de veau fœtal | Omega Scientific | FB-01 | |
| GlutaMAX-I (solution 100X) | Invitrogen | 35050 | |
| Solution vitaminée RPMI 1640 (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | |
| Solution d'acides aminés 1640 (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | |
| Pyruvate de sodium | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| β-Mercapto–éthanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Trisphosphate d'inositol | Sigma-Aldrich | 19766 | |
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | |
| Hydrobromure de poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Chlorure de lanthane | Sigma-Aldrich | 262072 | |
| Thapsigargine | Calbiochem | 586005 | |
| Kit d'élastomère de silicium Sylgard 184 | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| Revêtement protecteur pour semi-conducteurs HIPEC R6101 | Dow Corning | ||
| Table de laboratoire à isolation vibratoire haute performance série 63-500 | Technical Manufacturing Corp. | 63-540 | |
| Amplificateur de clampage de membrane EPC 10 avec tête amplificatrice | HEKA Instruments | ||
| Micromanipulateur | Sutter Instrument Co. | MP-285 | |
| Microscope inversé Olympus 1X71 avec objectif à immersion dans l'huile 40x | Olympus Corporation | 1X71 | |
| Ordinateur sous Windows | Dell | ||
| Logiciel Pulse | HEKA Instruments | ||
| Logiciel d'analyse et de représentation graphique scientifique Origin | OriginLab | ||
| Tireuse de pipettes pour patch | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Verre borosilicaté avec filament (D.E. : 1,5 mm et D.I. : 1,10 mm) | Sutter Instrument Co. | BF150-110-7.5 | |
| Microforge Narashige’s | Tritech Research, Inc. | MF-830 | |
| Joints toriques en silicone | McMaster-Carr | 111 S70 | |
| Lames couvre-objets de 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
Références
- Parekh, A. B. Store-operated CRAC channels: function in health and disease. Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).
- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. , (2010).
- Lewis, R. S., Cahalan,
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Réimpressions et autorisations
