Article de méthode

Isolement du cerveau et les cellules mononucléées de la moelle épinière utilisant gradients de Percoll

DOI :

10.3791/2348

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2 février 2011

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1Department of Biology and South Texas Center for Emerging Infectious Diseases, University of Texas at San Antonio - UTSA

Dans cet article

Résumé

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Le présent article décrit un protocole rapide pour isoler efficacement les cellules mononucléées du tissus de la moelle épinière du cerveau et qui peuvent être utilisés efficacement pour des analyses de cytométrie en flux.

Résumé

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Isolement des cellules du système immunitaire qui infiltrent le système nerveux central (SNC) lors d'une infection, un traumatisme, une auto-immunité ou de la neurodégénérescence, est souvent nécessaire pour définir leur phénotype et les fonctions effectrices. Des approches histochimiques sont instrumentales pour déterminer l'emplacement des cellules infiltrant et d'analyser le système nerveux central pathologie associée. Cependant, in situ histochimie et techniques en immunofluorescence sont limitées par le nombre d'anticorps qui peuvent être utilisés à un moment unique pour caractériser les sous-types de cellules immunitaires dans un tissu particulier. Par conséquent, les approches histologiques en conjonction avec le système immunitaire de phénotypage en cytométrie en flux sont essentielles pour caractériser complètement la composition de l'infiltration du SNC locales. Ce protocole est basé sur la séparation des suspensions cellulaires du SNC au cours gradients de Percoll discontinu. Le présent article décrit un protocole rapide pour isoler efficacement les cellules mononucléées du tissus de la moelle épinière du cerveau et qui peuvent être utilisés efficacement pour l'identification des différentes populations de cellules immunitaires dans un seul échantillon par cytométrie en flux.

Protocole

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Préparation des réactifs

Préparez le bouillon isotonique Percoll (SIP), 4 ml par le cerveau, en mélangeant 9 volumes de Percoll avec une partie de HBSS 10X sans Ca + + et Mg + +.

Préparer SIP à 70% en 1X HBSS sans Ca + + et Mg + +, 2 ml par le cerveau dispensés dans un tube de 15 ml en polypropylène coniques.

Note: Il est recommandé que Percoll doit être utilisée à température ambiante, s'il est utilisé à froid, les cellules ont tendance à s'agglutiner et à la séparation des cellules est moins efficace.

Collection de tissus et d'homogénéisation

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Discussion

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Les analyses des marqueurs de surface cellulaire dans les leucocytes dans les tissus du système nerveux central de souris normales et enflammée a été utilisé pendant plusieurs décennies 1-3. Protocoles d'isolement sont basés dans la séparation de la microglie et des leucocytes par centrifugation 4 densité. Nous décrivons ici une méthode rapide et efficace d'isoler les leucocytes SNC utilisant gradients de Percoll discontinu. Après isolement des cellules, la coloration avec des anticorps tel.......

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par la National Multiple Sclerosis Society (AT 3021-A1 / T pour AEC) et l'Université du Texas à San Antonio.

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Matériaux

Homogénéisation des tissus et Dégradés

  • Percoll (Amersham)
  • 10X Hanks Balanced Salt Solution, sans calcium et magnésium (Gibco)
  • Milieu RPMI 1640 sans rouge de phénol (Gibco)
  • 7 ml ou 15 ml de tissus Dounce Meuleuses (VWR)

La cytométrie en flux

  • Tampon de coloration cellulaire (Biolegend)
  • Rat purifié anti-souris CD16/CD32 (Souris BD Fc Block), BD Pharmingen
  • Hémacytomètre (Fisher)
  • Anti-souris CD45 (clone 30-F11), CD4 (clone RM4-5), CD19 (clone 6D5), BioLegend
  • Phosphate 10X saline tamponnée, sans calcium ni magnésium (Thermo Scientific)
  • Paraformaldéhyde (Sigma Aldrich)
  • L'analyse par cytométrie en flux effectuées avec un LSR II (BD Biosciences)

Références

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  1. Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
  2. Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N.

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Mots-clés

Mononuclear Cell IsolationPercoll GradientBrain Immune CellsSpinal Cord CellsFlow CytometryImmune PhenotypingCNS InfiltrationAntibody StainingCell SuspensionMicroglia Identification

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