Oligonucléotides peuvent être utilisés pour le site spécifiquement le remplacer par un seul nucléotide des gènes cibles transfectées dans les deux Anopheles gambiae Et Anopheles stephensi Cellules.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
La transfection et la mutagenèse des gènes cibles dans les cellules de moustiques en Fermés d'acide nucléique modifiés Oligonucléotides
Dans cet article
Résumé
Résumé
Parasites du genre Plasmodium, l'agent causal de la malaria, sont transmis par les piqûres de moustiques anophèles infectés résultant dans plus de 250 millions de nouvelles infections chaque année. Malgré des décennies de recherche, il n'ya toujours pas de vaccin contre le paludisme, en soulignant la nécessité de stratégies de contrôle roman. Une approche novatrice est l'utilisation de moustiques génétiquement modifiés pour lutter efficacement contre la transmission du parasite du paludisme. Altérations délibérées des voies de signalisation cellulaire chez le moustique, en passant par mutagenèse ciblée, ont été trouvés pour réguler le développement du parasite 1. De ces études, nous pouvons commencer à identifier les gènes cibles potentiels pour la transformation. Mutagenèse ciblée a toujours compté sur la recombinaison homologue entre un gène cible et une molécule d'ADN à grande. Cependant, la construction et l'utilisation de ces molécules d'ADN complexes pour la production de lignées de cellules transformées de façon stable est coûteux, fastidieux et souvent inefficace. Par conséquent, une stratégie utilisant des acides nucléiques verrouillés-oligonucleotides modifiés (LNA-ons) fournit une alternative utile pour l'introduction artificielle seule substitutions nucléotidiques dans épisomiques et chromosomiques cibles gène d'ADN (revue en 2). LNA-SUR-médiée mutagenèse ciblée a été utilisée pour introduire des mutations ponctuelles dans des gènes d'intérêt dans les cellules cultivées à la fois de la levure et de souris 3,4. Nous montrons ici que LNA-Ons peut être utilisé pour introduire un changement d'un seul nucléotide dans une cible transfectées épisomique qui se traduit par un interrupteur du bleu de protéines (BFP) l'expression fluorescentes pour la protéine verte (GFP) l'expression fluorescentes dans les deux Anopheles gambiae et Anopheles stephensi cellules . Cette conversion démontre pour la première fois que la mutagenèse efficace de gènes cibles dans les cellules de moustique peut être médiée par LNA-ons et suggère que cette technique peut être applicable à la mutagenèse des cibles chromosomiques in vitro et in vivo.
Protocole
- Avant de commencer le protocole, il est important de déterminer que les cellules de moustiques utilisés dans l'expérience sont en bonne santé et au confluent ~ 80% si adhérentes (Figure 1). Cellules envahies ou insalubres se traduira par une efficacité de transfection faible et donnera des résultats inconsistants.
- Warm up ensemble des médias avant d'utiliser dans un bain 28 ° C eau pendant 30 mn.
- A. stephensi MSQ43 cellules ont besoin de E5 moyennes: MEM, w Earle / glutamine, la chaleur de 5% FCS inactivé, 0,2% de D-glucose, 1% de pénicilline-antibiotique streptomycine et 1% non-acides aminés essentiels.
- A. gambiae cellul....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Nous présentons ici une méthode in vitro et des preuves pour la conversion ciblée d'un seul nucléotide dans un gène cible épisomique après transfection de LNA-Ons dans A. stephensi et A. cellules gambiae. Conversion génique LNA-SUR-médiation nécessite l'induction d'un site spécifique de réponse réparation de l'ADN; nos données indiquent que les cellules de moustique peut soutenir ce mécanisme de mutagenèse dirigée. Bien que la méthode présentée ici est basée s.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Nous tenons à remercier Abbie Spinner au Centre National Primate Research en Californie, pour son aide à la cytométrie de flux. Cette étude a été soutenue par un financement de l'Institut national des allergies et maladies infectieuses (NIAID) des National Institutes of Health (NIH) AI073745, AI080799 et AI078183.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Réactif de transfection Effectene | Qiagen | 301425 | |
| Plasmide témoin GFP (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | |
| Plasmide BFP (pcDNA5/FRT/TO) | Don du Dr Concordet3 | ||
| ON-LNA | Don du Dr Concordet3 | ||
| Milieu MEM, Earle’s avec glutamine | Invitrogen | 11095 | |
| Sérum de veau fœtal (FCS) | Invitrogen | 16000 | |
| Milieu de Schneider’s Drosophila | Invitrogen | 11730 | |
| Acides aminés non essentiels | Invitrogen | 11140 | |
| D-glucose à 10 % | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Antibiotique pénicilline-streptomycine | Invitrogen | 15140 | |
| Plaques de culture à 6 puits | Corning | 3516 |
Références
- Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).
- Braasch, D. A., Corey, D. R.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
Étiquettes
Oligonucléotides à acide nucléique verrouillémutagenèse dirigéetransfection de cellules de moustiquesexpression de protéines fluorescentesanalyse par cytométrie en fluxciblage génique épisomalcellules d'Anopheles gambiaeconversion de la BFP en GFPpréparation d'agents de transfectionsuivi de la densité cellulaire
