Administration virale ciblée aux neurones corticospinaux chez un rat néonatal pour étudier une lésion de la moelle épinière

Résumé

Source : Smit, R. D., et al. Ciblage du tractus corticospinal chez des rats nouveau-nés avec un double vecteur viral à l’aide de la chirurgie combinée du cerveau et de la colonne vertébrale. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo démontre l’administration ciblée de vecteurs viraux aux neurones corticospinaux chez un rat néonatal. Le protocole permet une expression précise des gènes à l’aide d’injections virales antérogrades et rétrogrades, facilitant ainsi la recherche sur la régénération neuronale et la plasticité après une lésion de la moelle épinière.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Injections directes dans la moelle épinière ciblant les terminaisons axonales

1. À l’aide de la pointe de l’aiguille d’injection en verre, approximez la ligne médiane de la moelle épinière en identifiant l’artère spinale. Cependant, si l’artère spinale est visiblement décentrée ou s’écarte de quelque manière que ce soit, approximez la ligne médiane en utilisant la position de l’apophyse épineuse C2 et en extrapolant celle-ci sur toute la longueur de la colonne vertébrale.
   REMARQUE : Chargez le virus dans l’injecteur en pipetant ~5 μL sur un morceau de parafilm, et positionnez l’aiguille de manière à ce que la pointe repose sur la gouttelette du virus.
2. Une fois identifiée, placez l’aiguille juste en arrière de la lame C5 sur la ligne médiane approximative et utilisez-la comme point de référence. Ensuite, à l’aide du micromanipulateur, déplacez l’aiguille latéralement vers la droite de 0,3 mm. Abaissez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle touche juste la surface de la moelle épinière ; À partir de cette profondeur, plongez l’aiguille à 0,6 mm dans la moelle épinière. Si nécessaire, continuez à plonger l’aiguille jusqu’à ce qu’elle perce la moelle épinière ; Ensuite, rétractez ou abaissez l’aiguille à la profondeur appropriée.
3. Injecter 1 μL de virus rétro-adéno-associé2-scCre à 250 nL/min. Une fois l’injection terminée, attendez 2 minutes pour que le virus se diffuse dans la moelle épinière avant de retirer lentement l’aiguille. Répétez les injections en utilisant les mêmes coordonnées latérales et de profondeur à deux autres sites dans la fenêtre vertébrale, l’un au milieu et le dernier juste en avant de la lame T1.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Flexible Needle Attachment	World Precision Instruments	MF34G-5	Pour nettoyer les aiguilles en verre et charger de l’huile rouge dans les aiguilles en verre.
Tubes capillaires en verre	World Precision Instruments	4878	Pour les aiguilles en verre tirées - doit être conçu pour les injecteurs de nanolitres.
Micromanipulateur avec échelle Vernier	Kanetec	N/A	Pour un ciblage précis pendant l’opération.
Instrument stéréotaxique standard de laboratoire	Stoelting	51600	Pour maintenir en place le support stérotaxique néonatal <
			Utilisé pour visualiser et mesurer le biseautage de tubes capillaires en verre tiré en aiguilles de verre fonctionnelles.
Contrôleur de pompe à microseringue	World Precision Instruments	62403	Pour contrôler le taux d’injection.
Nanoliter 2000 Pompe Tête Injecteur	World Precision Instruments	500150	Pour charger et injecter le virus de manière contrôlée.
pAAV-CMV-scCre	Wu lab		Plasmide
Cre pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmide #44361)	Le laboratoire de Bryan Roth à travers Addgene		DREADD plasmide
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	À utiliser avec les seringues de 1 ml et 10 ml pour permettre l’injection du modèle animal.
Pince à dents de rat	Roboz	RS-5152	Pour la préhension des apophyses épineuses.
Saline stérile	Baxter Healthcare Corporation	281324	Pour une utilisation dans la purification du sang et pour le remplacement des fluides après la chirurgie.
Gants chirurgicaux	N/A	N/A	: Pour une utilisation par le chirurgien pour maintenir le champ stérile pendant l’opération.
Coussin chauffant chirurgical	N/A	N/A	Pour maintenir la température corporelle du modèle animal pendant l’opération.
Microscope chirurgical	N/A	N/A	Pour une meilleure visualisation de la plaie chirurgicale.

td colspan='2' rowspan='1'>Étalon de laboratoire avec adaptateur pour souris et nouveau-nés 51615 Pour la fixation du crâne néonatal pendant la chirurgie crânienne et les injections vertébrales Microscope avec échelle de lumière et de vernier Oculaire Leitz Wetzlar N/A