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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
- Préparation de la seringue de micro-injection et du micro-injecteur pour l’injection :
- Verrouillez chaque seringue de micro-injection étanche au gaz dans le rack de la pompe de micro-injection.
- Placez l’extrémité de la seringue étanche au gaz dans l’eau stérile contenue dans un petit bateau de pesée et agitez doucement le piston pour lubrifier le fil interne. Tirez uniformément le piston vers la butée arrière de la pompe pour la remplir d’eau.
- Faites glisser le tube PE20 qui est connecté au micro-injecteur sur une aiguille de 26 G (embout brun) fixée à une seringue de 1 ml remplie d’eau stérile. Vaporisez de l’eau stérile à travers le micro-injecteur et inspectez le modèle et la distance de pulvérisation.
REMARQUE : L’eau doit être pulvérisée très loin et directement de l’embout du micro-injecteur. Si le jet n’est pas droit, l’emplacement de l’injection ne sera pas correct. - Placez le micro-injecteur stérilisé sur un champ stérile.
- Faites glisser le tube hors de l’aiguille, en maintenant le tube du micro-injecteur à la verticale pour empêcher l’eau de s’écouler tout en coupant le tube sous la zone endommagée par l’aiguille.
- Poussez légèrement le piston de la seringue de micro-injection vers l’avant pour créer une gouttelette à l’extrémité de l’aiguille et faites glisser le tube PE20 rempli d’eau (qui est connecté au micro-injecteur) sur l’aiguille.
REMARQUE : Cela créera une connexion liquide-liquide qui permettra une contre-pression appropriée qui pourrait déloger un bouchon qui pourrait se former à l’extrémité du micro-injecteur. - Poussez complètement le piston vers l’avant pour préparer le chargement de l’échantillon et assurez-vous qu’il ne reste aucune trace d’éthanol dans le micro-injecteur.
- Vérifiez que la configuration ne fuit pas en touchant plusieurs fois la gouttelette d’eau qui s’est formée à l’extrémité du micro-injecteur pour l’essuyer proprement.
- REMARQUE : Lorsque vous touchez la lingette de laboratoire, une seule tache humide doit se former. S’il y a plus de gouttes, il y a une fuite dans le système.
- Évitez les fuites en contrôlant l’application de super colle et en coupant le tube PE20 avec des ciseaux tranchants ou une lame de rasoir chaque fois que le tube PE20 est retiré de toute connexion.
- Tirez le piston de la seringue vers l’arrière de 0,2 μl, créant une bulle entre l’eau stérile dans le tube/micro-injecteur PE20 et la solution à injecter.
- REMARQUE : Cette bulle empêche la dilution de l’injectat, la contamination de l’eau et permet de surveiller le processus d’injection puisqu’elle se déplacera pendant l’injection. Une seule bulle solide doit être produite.
- Placez le micro-injecteur dans le réactif à injecter et tirez lentement le piston de la seringue vers la butée arrière.
- Préparation d’un animal pour l’injection :
- Tenez la poitrine du rat contre la poitrine de l’expérimentateur. Nettoyez la zone autour des canules à l’aide d’un applicateur en coton imbibé d’éthanol à 70 % (v/v).
- REMARQUE : Avec une manipulation appropriée, les souris peuvent être doucement attachées dans une main en coupe. Sinon, un écaillage peut être nécessaire.
- Retirez les obturateurs à l’aide de petites pinces et placez-les dans le bateau de pesée avec de l’éthanol à 70 % (v/v).
- Réalisation des injections :
- Placez le micro-injecteur rempli dans la canule. Appuyez sur le bouton de démarrage de la pompe de micro-injection et surveillez le mouvement des bulles.
- REMARQUE : Il peut être nécessaire d’appliquer une légère pression pour s’assurer que les micro-injecteurs ne se soulèvent pas. La bulle doit avancer uniformément et entrer complètement dans le micro-injecteur.
- Retirez les micro-injecteurs de la canule et remplacez les obturateurs, une fois l’injection terminée et la période de diffusion post-injection écoulée.
- REMARQUE : Les temps de diffusion post-injection typiques sont de 2 à 4 minutes pour les réactifs pharmacologiques et de 2 à 10 minutes pour les virus. Le fait de laisser le microinjecteur en place pendant la période post-perfusion empêche l’injecté de refluer dans les canules plutôt que de se diffuser dans les tissus. Placez les obturateurs sur le côté du bateau de pesée rempli d’éthanol pour permettre à l’éthanol de s’écouler avant de le réinsérer dans la canule.