Toutes les procédures impliquant le prélèvement d’échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l’IRB de l’institut.
1. Prolifération et différenciation des cellules lt-NES
REMARQUE : Les cellules souches neuroépithéliales auto-renouvelées à long terme dérivées de cellules souches pluripotentes humaines induites par l’homme sont générées et transduites avec un vecteur lentiviral porteur de la protéine fluorescente verte (GFP) sous un promoteur constitutif (cellules GFP-lt-NES). Les flacons contenant 3 x 106 cellules sont conservés à -150 °C jusqu’à leur utilisation.
1. Préparation des solutions mères et des supports
1. Diluer 100 μg de facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) dans 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) -0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA) pour avoir une concentration mère de 10 μg/mL. Préparez des aliquotes de 100 μL.
2. Diluer 100 μg de facteur de croissance épidermique (EGF) dans 10 mL de PBS-0,1 % BSA pour avoir une concentration stocke de 10 μg/mL. Préparez des aliquotes de 100 μL.
3. Aliquote 50x B27 supplément dans un volume de 100 μL par aliquote.
4. Diluer 10 mg de poly-L-ornithine dans 100 mL d’eau désionisée pour avoir une concentration de stock de 100 μg/mL. Faire 1 mL d’aliquotes.
5. Préparez 30 μL d’aliquotes de 1,20 mg/mL de laminine de souris.
6. Diluer 10 mL d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (0,25 %) dans 90 mL de PBS jusqu’à une concentration de base de 0,025 %. Préparez 1 mL d’aliquotes.
7. Diluer 0,025 g d’inhibiteur de trypsine dans 50 mL de PBS jusqu’à une concentration de base de 0,5 mg/mL. Préparez 1 mL d’aliquotes.
8. Diluer 10 μg de Wnt3a (membre de la famille 3A du site d’intégration MMTV de type Wingless) dans 1 mL de BSA PBS-0,1 % pour avoir une concentration stockeuse de 10 μg/mL. Préparez BMP4 (bone morphogenetic protein 4) de la même manière. Aliquote dans un volume de 100 μL.
9. Diluez 1 mg de cyclopamine dans 2,5 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO) jusqu’à une concentration finale de 400 μg/mL, et faites des aliquotes de 100 μL.
10. Préparez le milieu de base (Tableau 1) et le milieu de différenciation défini (DDM, Tableau 2), et conservez-le à 4 °C pendant 2 semaines maximum.
2. Revêtement des plats de culture
1. Pour pré-enrober les boîtes de culture des cellules GFP-It-NES pendant la prolifération ou la différenciation, diluez la poly-L-ornithine 1:100 dans de l’eau désionisée et ajoutez 5 mL de la solution dans une fiole T25. Incuber une nuit à température ambiante (RT).
2. Lavez les plaques revêtues de poly-L-ornithine 1x avec de l’eau désionisée et 1x avec du PBS.
3. Pour les cellules GFP-It-NES en prolifération, diluer la laminine de souris à 1:500 dans le PBS et incuber pendant au moins 2 h à 37 °C. Pour les cellules GFP-It-NES en différenciation, diluer la laminine de souris à 1:100 dans du PBS et incuber pendant au moins 2 h à 37 °C.
3. Prolifération des cellules GFP-lt-NES
1. Réchauffer 5 mL (pour le lavage) et 5 mL (pour l’ensemencement) de substrat basique dans deux tubes différents de 15 mL.
2. Décongelez rapidement un flacon de cellules GFP-lt-NES à 37 °C, transférez-les dans le tube de lavage et centrifugez-les à 300 x g pendant 5 min.
3. Aspirez le milieu avec précaution sans toucher la pastille et remettez les cellules en suspension dans 1 mL de milieu basique préchauffé. Transférez la suspension cellulaire dans le tube d’ensemencement contenant un milieu basique complété par des facteurs de prolifération : EGF (10 ng/mL), bFGF (10 ng/mL) et B27 (10 ng/mL). Ensemencez les cellules dans une fiole T25 enrobée de poly-L-ornithine/laminine.
4. Nourrissez les cellules avec des facteurs de prolifération tous les jours. Remplacez le fluide s’il jaunit. Passez les cellules tous les trois ou quatre jours (1 jour après qu’elles aient atteint 100 % de confluence).
4. Séparation des cellules GFP-lt-NES pour la prolifération et la différenciation
1. Préchauffer 5 mL de milieu basique par fiole (pour recueillir les cellules), plus le volume total nécessaire pour les réensemencer.
REMARQUE : Le passage se fait à une dilution de 1:3 pour maintenir les cellules en prolifération, nécessitant 15 mL de milieu basique, et à une dilution de 1:6 pour commencer la différenciation, nécessitant 30 mL de milieu basique
.
2. Retirer le milieu du flacon de culture cellulaire par aspiration et ajouter 500 μL de trypsine à 0,025 % préchauffée. Incuber pendant 5 à 10 min à RT. Le détachement des cellules peut être confirmé à l’aide d’un microscope optique standard à un grossissement de 10x.
3. Ajouter un volume égal d’inhibiteur de trypsine (concentration finale de 0,5 mg/mL) suivi de 5 mL de milieu basique chaud. Détachez et collectez les cellules en pipetant doucement de haut en bas. Transférez les cellules dans un tube de 15 mL et centrifugez pendant 5 min à 300 x g.
4. Pour maintenir les cellules en prolifération, replaquez à une dilution de 1:3 dans un milieu basique frais complété par des facteurs de prolifération, et répétez l’étape 1.3.4.
5. Différenciation corticale des cellules GFP-lt-NES
1. Le jour 0, remettre en suspension les cellules (à utiliser pour la différenciation) dans 30 mL de milieu basique complété par des facteurs de prolifération, et les déposer dans six fioles T25 revêtues de différenciation (divisées 1:6).
2. Le jour 1, changez la moitié du support en DDM, et ajoutez des facteurs de prolifération à la moitié de leur concentration.
3. Le jour 2, changez complètement le milieu pour le DDM complété par des facteurs de différenciation : BMP4 (10 ng/mL), Wnt3a (10 ng/mL) et cyclopamine (400 ng/mL).
4. Le jour 4, ajoutez uniquement les facteurs de différenciation. Remplacez le fluide s’il jaunit.
5. Le jour 6, changer le support en DDM complété par BMP4 et Wnt3a. La cyclopamine est éliminée à cette étape.
6. Le jour 7, détachez les cellules comme indiqué à l’étape 1.4.2 et à l’étape 1.4.3.
2. Transplantation des cellules GFP-lt-NES dans des coupes organotypiques hACtx
REMARQUE : Le tissu cortical humain adulte (hACtx) doit être cultivé pendant 1 semaine avant la transplantation cellulaire. Pour faciliter la procédure de transplantation, il est nécessaire de retirer 2 ml du milieu hACtx du haut de l’insert pour éviter que le tissu ne flotte.
1. Remettre en suspension les cellules GFP-lt-NES amorcées corticalement (à partir de l’étape 1.5.6) dans une matrice de membrane basale pure et froide (voir le tableau des matériaux) à une concentration de 1 x 105 cellules/μL et transférer la solution dans un tube stérile plus petit.
REMARQUE : Pendant la procédure de transplantation, tous les matériaux (pointes de pipette, tubes, capillaires, etc.) doivent être pré-refroidis pour éviter la solidification du gel. Décongeler le gel matriciel de la membrane basale sur de la glace pendant 30 minutes avant de l’utiliser.
2. Recueillir la suspension cellulaire dans un capillaire en verre froid relié à une tétine en caoutchouc pour l’aspiration. Injectez la suspension cellulaire en petites gouttes (environ 1 μL chacune) en poignardant la tranche de tissu semi-sec à différents endroits.
3. Incuber à 37 °C pendant 30 min pour que le gel se solidifie. Transférez la plaque de l’incubateur vers le capot et ajoutez soigneusement 2 ml de milieu hACtx sur le haut de l’insert pour immerger complètement le tissu.
4. Remplacez le milieu de culture par un milieu hACtx frais une fois par semaine.