Injection stéréotaxique de virus pour une modification génétique stable dans un modèle murin

Résumé

Source : Porlan, E., et al. Modification génétique stable et efficace des cellules de la souris adulte V-SVZ pour l’analyse des effets autonomes et non autonomes des cellules souches neurales. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo démontre la modification génétique stable des cellules souches neurales (CSN) dans la zone ventriculaire-sous-ventriculaire (V-SVZ) par injection stéréotaxique d’un gène thérapeutique porteur du virus dans un modèle murin. Le virus pénètre dans les CSN, subit une transcription inverse, s’intègre dans le génome et permet une modification génétique stable et efficace pour des applications neurothérapeutiques.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Injection stéréotaxique du ventricule latéral (VG) dans la zone ventriculaire-sous-ventriculaire (V-SVZ)/bord du striatum ou dans le

1. VG Micro-injection de LV
   1. Sélectionnez et stérilisez les outils nécessaires à la chirurgie (scalpel, perceuse et petite pince à épiler).
   2. Anesthésie une souris âgée de 6 à 8 semaines par injection intrapéritonéale (ip) d’un mélange de kétamine et de médétomidine supervisé par un vétérinaire. Pesez chaque animal et administrez chacun 50 à 75 mg de kétamine et 0,5 à 1 mg de médétomidine par kg de poids corporel de souris (environ 100 à 125 μl de la solution de travail kétamine/médétomidine par souris).
   3. Évaluez le plan anesthésique en pinçant les orteils, la queue ou l’oreille et en vous assurant que l’animal ne montre aucune réaction.
   4. Une fois la souris anesthésiée, injecter du butorphanol par voie sous-cutanée à une dose finale de 0,4 à 0,5 mg par kg de poids de souris pour minimiser la douleur post-chirurgicale.
   5. Rasez la zone entre les oreilles et désinfectez la peau à l’aide d’un iodophore tel que l’iodopovidone ou l’éthanol à 70 %. Nettoyez à l’aide d’applicateurs stériles à embout de coton. Veillez à ne pas trop mouiller l’animal, car cela peut exacerber l’hypothermie.
   6. Placez l’animal en position couchée sur un cadre stéréotaxique et fixez soigneusement la tête à l’aide des barres auriculaires et du support abdominal de l’appareil. Gardez la souris avec un coussin chauffant réglé à 37 °C et appliquez un lubrifiant ophtalmique sur les yeux.
   7. Faites une incision longitudinale de 1 cm de long sur la peau de la tête à l’aide d’un scalpel et rétractez doucement la peau pour exposer le crâne à l’aide d’une pince à épiler fine.
   8. Nettoyez soigneusement la surface de l’os à l’aide d’un applicateur stérile à embout de coton. Nettoyez l’os du crâne exposé de tout tissu restant.
   9. Montez la seringue stérilisée sur l’appareil stéréotaxique à l’aide du porte-seringue.
   10. Déplacez le porte-seringue le long des axes x, y et z jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille de la seringue soit positionnée sur le bregma, le point de conjonction où la suture sagittale (longitudinale et médiale) est perpendiculairement coupée par la suture coronale (Figure 1b). S’assurer que la position « zéro » de l’axe dorso-ventral (DV) se trouve à la surface du crâne au niveau de la bregma.
   11. Déplacez la seringue jusqu’aux coordonnées de destination x et y (voir le tableau 1 et la figure 1b).
   12. Annotez les coordonnées x, y et z de la destination sur l’échelle de Vernier afin de pouvoir revenir au site d’injection par la suite. Marquez l’os aux coordonnées x et y à l’aide d’un marqueur chirurgical.
   13. Éloignez la seringue de la zone de travail.
   14. À l’aide d’une perceuse électrique, faites un trou dans le crâne avec précaution afin de ne pas endommager le cerveau. Ne percez pas la surface piale, car cela pourrait endommager la surface du cerveau.
   15. Chargez la seringue avec 1 μl de la solution virale 10⁶ TU/μl (unités de transduction par microlitre). Utilisez une aiguille biseautée pointue de calibre 33 dont la pointe a un angle de 10 à 12°. Positionnez l’aiguille de la seringue à un angle de 90° par rapport à la surface du cerveau.
   16. Ramenez la seringue jusqu’au site d’injection et descendez-la jusqu’à ce que l’extrémité touche la surface piale.
   17. Pénétrez le cerveau avec la seringue à la coordonnée z dans l’axe DV.
   18. Libérez lentement la suspension virale à un taux de 0,2 μl/min afin de minimiser les dommages au tissu cérébral dus à une pression excessive du fluide.
   19. Attendez 5 à 10 minutes pour minimiser le reflux de la suspension virale, puis rétractez la seringue très lentement.

Région d’injection	Coordonnées
	antéro-postérieures (AP)	Médio-latérales (ML)	Dorso-ventrales (DV)
SEZ/bord du striatum	+0,6 mm	+1,2	mm-3,0 mm
Ventricule	latéral-0,3 mm	+1,0	mm-2,6 mm

Tableau 1 : Coordonnées stéréotaxiques pour les injections. Pour les axes antéro-postérieur (AP) et médio-latéral (ML), les coordonnées x et y sont données à une distance (en mm) du bregma. « - » indique « vers l’arrière ». Pour les coordonnées DV, « zéro » est la surface du crâne au point de bregma, et les coordonnées DV indiquent la distance (en mm) vers le bas à partir de ce point.

Résultats

Figure 1 : Représentation schématique des différentes parties de la procédure. (a) Génération de LV pour des études de marquage in vivo, depuis la transfection de cellules 293T (HEK293T) de rein embryonnaire humain avec des plasmides appropriés ...

Matériaux