Administration soutenue d’un facteur de croissance nerveuse à l’aide d’un film de silicium poreux dans des cellules de phéochromocytome de rat 12

Résumé

Source : Rosenberg, M., et al. Conception de films de silicium poreux comme porteurs de facteur de croissance nerveuse. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo démontre l’utilisation d’un film de silicium poreux nanostructuré (PSi) dégradable pour la libération prolongée de facteur de croissance nerveuse (NGF) afin de soutenir la différenciation des cellules PC12. Le NGF est adsorbé sur les pores du film par des interactions électrostatiques et est progressivement libéré dans le milieu par diffusion et dégradation de l’échafaudage. Cette administration contrôlée favorise la survie des cellules PC12 et facilite la croissance et la ramification des neurites sur une période prolongée.

Protocole

1. Fabrication de supports de silicium poreux oxydé (PSiO₂)

1. Découpe une plaquette de silicium (Si) (face unique polie sur la face <100> et fortement dopée au bore, de type p, 0,95 mΩ·cm) en échantillons de 1,5 cm × 1,5 cm à l’aide d’un stylo à pointe de diamant.
2. Oxyder les échantillons de Si dans un four tubulaire à 400 °C pendant 2 h à l’air ambiant (vitesse de chauffage : 25 °C/min, refroidissement naturel).
3. Immergez les échantillons de Si dans une solution aqueuse d’acide fluorhydrique (HF) (48 %), d’eau doublement distillée (ddH₂O) et d’éthanol (99,9 %) (1:1:3 v/v/v) pendant 5 min, puis rincez les échantillons à l’éthanol trois fois et séchez-les sous un flux d’azote.
   REMARQUE : Préparez et stockez la solution HF dans de la vaisselle en plastique uniquement, car le HF dissout le verre.
   ATTENTION: Le HF est un liquide très corrosif et doit être manipulé avec une extrême prudence. En cas d’exposition, rincer abondamment à l’eau et traiter la zone touchée avec du gel antidote HF ; Consultez immédiatement un médecin.
4. Montez l’échantillon de Si dans une cellule de gravure en polytétrafluoroéthylène, en utilisant une bande de feuille d’aluminium comme contre-contact et une bobine de platine comme contre-électrode.
5. Gravure d’une couche sacrificielle dans une solution 3:1 (v/v) de HF aqueux et d’éthanol (99,9 %) pendant 30 s à une densité de courant constante de 250 mA/cm², puis rincer trois fois la surface du film PSi obtenu avec de l’éthanol et sécher sous un courant d’azote.
6. Dissoudre la couche poreuse fraîchement gravée dans une solution aqueuse d’hydroxyde de sodium (NaOH) (0,1 M) pendant 2 min. Ensuite, rincez trois fois à l’éthanol et séchez sous un jet d’azote.
7. Immerger l’échantillon dans une solution aqueuse de HF (48 %), de ddH₂O et d’éthanol (99,9 %) (1:1:3 v/v) pendant 2 min. Ensuite, rincez trois fois à l’éthanol et séchez sous un jet d’azote.
8. Graver électrochimiquement l’échantillon de Si dans une solution 3:1 (v/v) de HF aqueux et d’éthanol (99,9 %) pendant 20 s à une densité de courant constante de 250 mA/cm², puis rincer trois fois la surface du film PSi obtenu avec de l’éthanol et sécher sous un flux d’azote.
9. Oxyder thermiquement les échantillons PSi fraîchement gravés dans un four tubulaire à 800 °C pendant 1 h à l’air ambiant (vitesse de chauffage : 25 °C/min, refroidissement naturel) pour former un échafaudage poreux SiO₂ (PSiO₂).
10. Appliquez une photorésine épaisse positive sur les échantillons PSiO₂ à 4 000 tr/min pendant 1 min, puis faites cuire les échantillons revêtus à 90 °C pendant 2 min (vitesse de chauffage : 5 °C/min, refroidissement naturel).
11. Coupez les échantillons PSiO₂ en échantillons de 8 mm × 8 mm à l’aide d’une scie à découper.
12. Pour éliminer la résine photosensible, trempez les échantillons coupés en dés dans de l’acétone pendant 3 h, puis rincez abondamment à l’éthanol et séchez-les sous un jet d’azote.

2. Chargement du PSiO₂ avec le facteur de croissance nerveuse (NGF)

1. Pour préparer la solution de chargement du NGF, dissolvez 20 μg de β-NGF murin dans 400 μL de solution 1:1 (v/v) de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 0,01 M et de ddH₂O.
2. Ajoutez 52 μL de la solution de chargement sur l’échantillon PSiO₂ et incubez pendant 2 h à température ambiante (RT) dans une boîte bouchée.
   REMARQUE : Maintenez une humidité élevée dans la boîte pour éviter que la solution ne se dessèche pendant l’incubation.
3. Prélever la solution au-dessus de l’échantillon pour la quantification ultérieure de la teneur en NGF dans le support PSiO₂.
   REMARQUE : Le chargement du NGF dans le PSiO₂ doit être effectué immédiatement avant l’utilisation prévue ; le protocole ne peut pas être interrompu ici en raison du risque de séchage et de dénaturation de la protéine.

3. Viabilité cellulaire et croissance en présence de porteurs de PSiO₂ chargés de NGF

1. Culture cellulaire de phéochromocytome de rat (PC12)
   1. Préparez le milieu de croissance de base en ajoutant 10 % de sérum de cheval (HS), 5 % de sérum de bovin fœtal (FBS), 1 % de L-glutamine, 1 % de pénicilline-streptomycine et 0,2 % d’amphotéricine au milieu de l’Institut médical Roselle Park (RPMI).
   2. Préparez un milieu de différenciation en ajoutant 1 % de HS, 1 % de L-glutamine, 1 % de pénicilline-streptomycine et 0,2 % d’amphotéricine au milieu RPMI.
   3. Suspension de cellules de culture (10 à⁶ cellules) dans une fiole de^{culture de 2} cm avec 10 ml de milieu de croissance basique pendant 8 jours ; tous les 2 jours, ajouter 10 ml de milieu de croissance basique dans la fiole.
   4. Pour générer une culture cellulaire PC12 différenciée, transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger ; centrifugez les cellules pendant 8 min à 200 x g et RT. Jetez le surnageant.
   5. Mettre les cellules en suspension dans 5 mL de milieu de croissance basique frais et les centrifuger de nouveau pendant 5 minutes à 200 x g et RT ; jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellules dans 3 mL de milieu de croissance basique.
   6. Pour séparer les amas de cellules, aspirez les cellules dix fois à l’aide d’une seringue de 23 G.
   7. Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules hémicytométrique et ensemencer 10 cellules de⁴ cellules/cm² de surface de travail sur des plaques de collagène de type I en présence d’un milieu de différenciation.
   8. Après 24 h, ajoutez du β-NGF (50 ng/mL) ou du support PSiO₂ chargé en NGF par plaque.
      >REMARQUE : Des concentrations plus élevées de NGF (>50 ng/mL) ont exactement l’effet de la concentration spécifiée.
   9. Renouveler le milieu de différenciation tous les 2 jours.
   10. Pour évaluer la viabilité cellulaire, ajouter 10 % (v/v) de la solution indicatrice de viabilité (à base de résazurine) à des points temporels représentatifs et incuber pendant 5 h à 37 °C ; mesurer l’absorbance à 490 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acetone	Gadot	830101375
Amphotéricine	Biological Industries	03-028-1B
Aqueous HF (48 %)	Merck	101513
AZ4533 photoresist	Metal Chem, Inc.	AZ4533
BSA fraction v	MP biomedicals	216006950
solution BSA (10 %)	Biological Industries	03-010-1B
Collagène de type l	Corning Inc.
Collagenase	Enco	LS004176
Lamelles en plastique enduites de collagène	NUNC Thermanox	1059846
D-(+)-glucose	Sigma-Aldrich Chemicals	G8170
Dispase-II	Sigma-Aldrich Chemicals	4942078001 Absolu d’éthanol
(99,9 %)	Merck	818760
FBS	Biological Industries	04-121-1A
Guanidine-HCl	Sigma-Aldrich Chemicals	G7294
Mélange de nutriments Ham F-12 Thermo	Scientific	11765054
HBSS	Thermo Scientific	14185-045
HEPES (1M)	Thermo Scientific	15630-056
HS	Biological Industries	04-124-1A
L-15 medium	Sigma-Aldrich Chemicals	L5520
Laminin	Thermo Scientific	23017015
L-glutamine	Biological Industries	03-020-1A
Murine β-NGF	Peprotech	450-34-20
Âne normal sérum (NDS)	Sigma-Aldrich Chemicals	G9023
Papain	Sigma-Aldrich Chemicals	p-4762
PBS (pH 7,4)			Préparé par dissolution de 10 mM de Na₂HPO₄, 1,8 mM de KH₂PO₄, 137 mM de NaCl et de 2,7 mM de KCl dans de l’eau bidistillée (ddH₂O, 18 MΩ·cm).
PBS X10	Biological Industries	02-020-1A
Lignée cellulaire PC12	ATCC	CRL-1721
Pénicilline-streptomycine	Biological Industries	03-032-1B
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich Chemicals	P4832
Réactif PrestoBlue	Thermo Scientific	A13261
RPMI medium	Biological Industries	01-100-1A
Si, plaquette	Siltronix Corp.		Hautement dopé B, type p, résistivité de 0,00095 Ω cm, orienté <100>
azoture de sodium	Sigma-Aldrich Chemicals	S2002
Hydroxyde de sodium (NaOH)	Sigma-Aldrich Chemicals	S8045
Acide tannique	Sigma-Aldrich Chemicals	403040
Triton X-100	Chem-Impex International Inc.	1279

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