Analyse de la cinétique ARNm exportation nucléaire dans les cellules de mammifères par micro-injection

Résumé

Nous décrivons ici un test qui utilise la puissance du micro-injection couplé à fluorescence In situ afin de mesurer avec précision la cinétique de l'exportation nucléaire de l'ARNm dans les cellules somatiques de mammifères.

Résumé

Chez les eucaryotes, l'ARN messager (ARNm) est transcrit dans le noyau et doivent être exportés dans le cytoplasme d'accéder à la machinerie de traduction. Bien que les exportations nucléaires de l'ARNm a été largement étudié dans des ovocytes de Xénope ¹ et les organismes génétiquement traitables comme la levure et la drosophile ^deux lignée dérivée de cellules S2 ^3, peu d'études avaient été menées dans les cellules de mammifères. De plus la cinétique de l'exportation d'ARNm dans les cellules somatiques de mammifères ne pouvaient être déduites indirectement à ^4,5. Afin de mesurer la cinétique de l'exportation nucléaire de l'ARNm dans les cellules de culture de tissus de mammifères, nous avons développé un test qui utilise la puissance du micro-injection couplé avec d'hybridation fluorescente in situ (FISH). Ces tests ont été utilisés pour démontrer que des cellules de mammifères, la majorité des ARNm sont exportés de manière épissage dépendants ^6,7, ou de manière qui exige des séquences spécifiques d'ARN tels que la région séquence signal de codage (SSCR) ^6. Dans cet essai, les cellules sont microinjectés soit in vitro avec des ARNm synthétisés ou ADN plasmidique contenant le gène d'intérêt. Les cellules sont incubées pendant microinjectés divers moments alors fixé et la localisation sous-cellulaire des ARN est évaluée en utilisant FISH. Contrairement à la transfection, où la transcription a lieu plusieurs heures après l'ajout d'acides nucléiques, la microinjection d'ADN ou d'ARNm permet l'expression rapide et permet de générer des données précises cinétique.

Protocole

Il existe deux méthodes à base de micro-injection qui peut être utilisé pour mesurer la cinétique de l'exportation d'ARNm dans les cellules de mammifères, l'injection d'ARNm synthétisé in vitro, ou de l'ADN plasmidique, qui est transcrit en ARNm in vivo. Chaque technique a ses avantages et ses inconvénients. Nous décrivons ici les deux techniques et de discuter des différences entre les deux approches.

1. Préparation du matériel pour l'injection

1. In vitro l'ARNm transcrit
   1. L'ARNm est transcrit à partir de deux plasmides ou produits de PCR contenant le gène d'intérêt flanqué en amont par le promoteur d'ARN polymérase appropriée (c.-T7 ou SP6 promoteurs). La transcription est réalisée in vitro en utilisant l'enzyme approprié (T7 ou SP6 ARN polymérase, Invitrogen) avec les nucléotides appropriés et analogique bouchon excès.
   2. Les transcriptions sont polyadénylé in vitro en utilisant Poly-A-polymérase (Invitrogen) et l'ATP, conformément aux protocoles du fabricant.
   3. L'ARNm est ensuite purifié à l'aide de colonnes soit de Invitrogen ou Qiagen.
   4. ARNm éluées sont ensuite précipité par addition d'acétate de potassium 1/20ème du volume de 3M et de 2 volumes d'éthanol 100% à -20 ° C pendant une heure, suivie d'une centrifugation à 13000 g à 4 ° C pendant 30min. Si l'excès de liquide est présent, le culot peut être lavée avec de la glace 70% d'éthanol froid.
   5. L'ARNm résultant culot est séché à l'air, puis solubilisés dans le tampon d'injection (140mm HEPES 10mM KCl et, pH 7,4). Notez que toute l'éthanol contaminant peut être toxique pour la cellule microinjectés. L'ARNm solubilisés peuvent être conservés à -80 ° C pour stockage à long terme.
   6. Pour la microinjection, l'ARNm est dilué à 200μg/ml dans le tampon d'injection et mélangé avec Oregon Green 488 (OG) conjugué 70kDa dextrane (1mg/ml; Invitrogen). Depuis le dextrane OG-conjugué est trop grand pour diffuser à travers le pore nucléaire, il permettra à un non seulement d'identifier les cellules injectées, mais aussi aider à déterminer quelle quantité de liquide est injecté dans le noyau et combien sont déversés dans le cytoplasme ( voir 4.1.2). Sinon, toute fluorescente, la molécule de haut poids moléculaire qui est incapable de traverser le pore nucléaire peuvent être utilisés.
   7. Les échantillons sont centrifugés à 13000 g à 4 ° C pendant au moins 20min avant le chargement de l'aiguille afin de granulés de toute particule qui pourrait éventuellement obstruer la pointe de l'aiguille.
2. L'ADN plasmidique
   1. L'ADN plasmidique contenant le gène d'intérêt peut être préparée en utilisant la norme des kits de purification d'ADN de Qiagen. Des préparations d'ADN généralement plus grandes ont tendance à être de qualité supérieure et sont donc plus efficacement transcrit après l'injection.
   2. L'ADN plasmidique est dilué de 50 à 200μg/ml dans le tampon d'injection contenant OG-conjugués de 70 kDa (1mg/ml) dextrane.
   3. Avant de charger l'aiguille, le fluide d'injection est centrifugé à 13000 g à 4 ° C pendant au moins 20min.
3. Aiguilles pour la microinjection
   1. Les aiguilles sont fabriqués à partir de 1.0mm tubes capillaires en verre borosilicate (Item # 1B100F-3; World Precision Instruments Inc) en utilisant une Sutter p97 Flaming / Brown Micropipette Extracteur avec un filament de 2,5 mm.
   2. Les aiguilles d'injection sont générés en utilisant un programme en trois étapes en tirant à l'aide d'un filament 2.5x4.5 mm boîte (item # FB245B, Sutter Instrument Co.). Les paramètres du programme utilisé dans cette expérience sont énumérés ci-dessous, cependant ils doivent être optimisés pour chaque filament.

      Étape #	Chaleur	Tirez	La vitesse	Temps	Pression
      1	740	100	8	250	500
      2	740	100	8	250	500
      3	740	100	10	250	500

      
      (Montée en température = 740)
4. Préparation de cellules
   1. Généralement, toute lignée cellulaire de mammifère peut être microinjectés, cependant les types de cellules qui sont bien réparties ont tendance à être plus favorable à l'injection. Le choix de la lignée cellulaire peut également dépendre d'autres facteurs. Par exemple, les ARNm qui codent pour des protéines sécrétées sont ciblés à la surface du réticulum endoplasmique et cela est beaucoup plus visible dans les cellules COS-7 par rapport à des fibroblastes NIH 3T3 ⁶ (comparer la localisation des t-FTZ-Δi ARNm dans les figures 3 et 4).
   2. Les cellules doivent être ensemencées sur des lamelles lavée à l'acide carrés (25x25 mm) en petridishes de 30mm pour au moins 24 heures avant la microinjection. Dans certaines lignées cellulaires, la propagation peut être stimulée par les cellules de placage sur la fibronectine lamelles revêtement ^6,8. Idéalement, la monocouche cellulaire devrait être à peu près 70-90% confluentes au moment de l'injection.
   3. Afin de permettre une identification facile des cellules injectées, la monocouche cellulaire est blessé avant l'injection en utilisant un embout en plastique 200 pl pipette. Généralement une blessure croix (figure 1) est gravé sur la lamelle et les cellules sont laissées à récupérer pendant au moins 15min avant l'injection dans l'incubateur de culture tissulaire.
   4. Pendant la microinjection, les milieux de culture tissulaire perd lentement de CO ₂ à la diffusion et à la suite devient alcaline. Pour aider à maintenir un pH neutre pendant l'injection, les médias peuvent être complétées avec HEPES 10mM pH 7,4. Le tampon supplémentaire peut être ajouté à la presse le jour avant la microinjection.
5. Le microscope et Micromanipulateur
   1. Les cellules sont microinjectés utilisant un microscope inversé qui est isolé sur une table de l'air pour minimiser les vibrations qui peuvent perturber les processus de microinjection. Le microscope est équipé de deux objectifs; un morceau sèche 10x, ce qui est utilisé pour positionner les cellules et l'aiguille, et un sèche 40x supplémentaires objectif à long phase de travail à distance, qui est utilisé pour l'image du processus de microinjection.
   2. Les aberrations optiques causées par des cellules à travers la visualisation lamelle et PetriDish peut être éliminée si l'objectif a une bague de correction. Veiller à ce que le microscope fond clair est correctement alignée pour éclairage de Köhler ^9, aidera également à corriger les aberrations causées par la lumière étant diffusée par l'aiguille d'injection (voir 2.2.4).
   3. L'aiguille est contrôlé par un à trois axes joystick micromanipulation pendaison (NT-88-V3MSH, Narishige). Le manipulateur grossière est fixé au pilier dorsal du microscope pour permettre à l'aiguille pour être facilement soulevé et abaissé dans le plat tout en conservant sa position initiale.
   4. L'aiguille est fixée à une baguette qui est serrée sur le manipulateur grossière. Un tube relie la baguette d'une seringue en verre 5cc (Item # 512311; Becton Dickinson), qui génère la pression d'injection nécessaire pour éjecter le fluide de la pointe de l'aiguille de microinjection. Pour contrôler le niveau de pression, le corps de la seringue et le piston sont maintenus en position par un régulateur de seringue qui se compose de deux bouchons, un collier de serrage (disponible à n'importe quelle quincaillerie) et deux pinces métalliques (figure 2). Afin de s'assurer que la seringue maintient la pression élevée, graisse à vide (Dow Corning) est appliqué à piston de la seringue.
6. La sonde d'hybridation fluorescente
   1. La séquence primaire de l'acide nucléique est injecté plié en utilisant l'ARN du logiciel de prédiction de structure secondaire, comme RNAstructure 4,6 ^10.
   2. Les plis ARNm sont évalués visuellement pour identifier une région d'environ 50 nucléotides qui tend à être libre de structures secondaires avec des températures de fusion élevé, tels que longs brins doubles.
   3. Le complément inverse de cette région est synthétisé avec un fluorophore Alexa546 attaché à l'extrémité 5 'de la sonde (elles peuvent être achetés auprès de DNA Technologies intégré).
   4. La sonde est dilué avec de l'eau à une concentration de 100 microns et est stocké à -80 ° C pour les 2-3 ans.

2. Microinjection intranucléaire

1. Chargement du fluide d'injection sur le microscope microinjection
   1. Environ 1 microlitre du fluide d'injection est tiré de l'ADN de l'échantillon centrifugé ou ARNm en utilisantGELoader conseils (Item # 022351656; Epindorff). Liquide doit être aspiré par le haut de l'échantillon pour éviter de perturber le culot qui contient les particules qui peuvent obstruer l'aiguille.
   2. La pointe de la pipette est insérée dans l'extrémité arrière de l'aiguille et le liquide est éjecté. Liquid sera tiré au bout de l'aiguille par capillarité et un ménisque près de la pointe doit être visible dans les 5-30sec.
   3. L'aiguille remplie de liquide est inséré dans la baguette, qui est ensuite calée sur le micromanipulateur à un angle de 45 °.
   4. L'aiguille est visualisée avec l'objectif 10x et est positionné dans le centre de l'avion d'observation près du plan focal en utilisant les boutons micromanipulateur grossière. L'aiguille est ensuite soulevé quelques millimètres à l'empêcher d'être endommagé dans les étapes ultérieures (2.2.2) et ensuite le pilier dorsal microscope est repoussé.
   5. La pression est augmentée en appuyant sur le piston de 0,5 2cc.
2. Microinjection
   1. Un PetriDish contenant une lamelle avec une monocouche blessé est placé sur la scène de visualisation.
   2. Le pilier dorsal microscope est tiré vers l'avant à une position verticale, ce qui provoque le condenseur pour être alignés et l'aiguille d'entrer dans le liquide. Cela devrait être fait avec soin pour éviter que l'aiguille de se casser sur la lamelle (voir 2.1.4).
   3. Utilisation de l'objectif 10x, le centre de la plaie croix est identifié et que l'aiguille est positionnée au-dessus des cellules à injecter.
   4. Le grossissement est accrue par le passage à l'objectif 40x et l'aiguille est abaissé et centré en utilisant les boutons de réglage fin sur le joystick. Si l'image est floue, il faut s'assurer que la lumière incidente est correctement aligné (c'est à dire l'éclairage Kolher ⁹⁾ en utilisant une lentille de Bertrand (voir 1.5.2).
   5. L'injection doit débuter à un coin de la croix de la plaie et continue sur un bord pour faciliter l'identification de cellules injectées au cours de visualisation (voir Figure 1).
   6. L'aiguille est abaissée à prendre contact avec le noyau. On peut facilement dire que la cellule a été injecté par le changement notable dans la phase de luminosité qui accompagne l'injection.
   7. Si le liquide se remplit toute la cellule, cela peut indiquer que la pression est trop élevé et doit être abaissé.
   8. Si aucun changement de luminosité phase est détecté, cela peut indiquer que la pression soit microinjection n'est pas assez forte pour percer la membrane cellulaire, ou que la pointe de l'aiguille est bouchée. Cela peut être le résultat d'un certain nombre de questions, notamment: une pression insuffisante, les imperfections dans l'aiguille, et le blocage de l'aiguille avec des petites particules. Depuis le chargement de chaque aiguille dans le micromanipulateur prend du temps, et depuis le substrat d'injection est souvent très précieux, il est important de maximiser le pourcentage d'aiguilles qui peuvent être efficacement utilisées pour les injections. Ci-dessous est une étape par étape pour tenter de débloquer un bout de l'aiguille bouchée. Après chaque étape, on devrait essayer d'injecter 2-3cells d'évaluer si l'obstruction a été enlevée:

      	Action	Objet et but
      1	Réglez la mise au point de vue la longueur de la pointe de l'aiguille.	Pour déterminer s'il ya une imperfection évidente dans l'aiguille ou si il ya un grand morceau de particules bloquant la pointe.
      2	Placez la pointe de l'aiguille à côté d'un morceau flottant de particules dans le plat.	Si le fluide est sortie de la pointe elle devrait agiter les particules sans entrer en contact direct avec l'aiguille.
      3	Appuyez sur le piston jusqu'à la fin de la seringue	Cette augmentation temporaire de la pression devrait effacer toute obstruction à la pointe. Après avoir sorti le piston, il devrait augmenter de son propre chef, si elle n'a pas, ce moyen de pression n'est pas intégré dans la seringue et vous avez besoin pour resserrer les liens et / ou ajouter de la graisse à vide supplémentaire.
      4	Relevez l'aiguille hors de la cellule de medIA	La force du dessin l'aiguille des médias aqueuse peut aider à déloger les obstructions à la pointe de l'aiguille.
      5	Retirer le piston de la seringue entièrement et le réinsérer.	Cette augmentation supplémentaire de la pression peut être nécessaire pour dégager l'extrémité de l'aiguille.
      6	Grattez la pointe de l'aiguille sur une partie propre de la lamelle	Cette autre agite les particules au sein de l'aiguille et l'aide à repositionner pour soulager l'obstruction à la pointe. Stronger gratter peut puce à l'extrémité de la pointe, permettant de l'obstruction à la sortie de l'aiguille.
      7	Charger une nouvelle aiguille

      
      
      Un autre problème commun est la perte progressive de la pression au sein de l'aiguille, ce qui nécessite une indemnisation fréquentes encore appuyant sur le piston de la seringue. Souvent, l'ajout de graisse à vide supplémentaire au piston de la seringue peut aider à maintenir la pression plus constante. Toutefois, ce problème peut être dû à des fuites des liens entre la seringue et le tube, le tube et la baguette, ou la baguette et l'aiguille. La plupart des fuites d'air peuvent être scellés à l'aide Parafilm (Fisher) ou de la graisse, si nécessaire, bien que les fuites entre la baguette et l'aiguille ne peut être corrigé en changeant le joint en caoutchouc dans la baguette.
   9. Les cellules le long d'un bord de la plaie sont microinjectés le long du bord plaie pendant une période de temps déterminée (10-15min). Avec la pratique de plusieurs centaines de cellules peuvent être injectées au cours de cet intervalle.
   10. Après microinjection, les cellules sont incubées à 37 ° C dans un incubateur de culture tissulaire pour la quantité désirée de temps avant la fixation. Si l'injection d'ADN, la transcription est terminée après 20 minutes en traitant les cellules avec des α-amanitine (1μg/ml; Sigma-Aldrich) dissous dans un milieu de croissance. Cette concentration inhibe efficacement la transcription à partir du plasmide microinjectés (figure 3).
   11. Une seule aiguille peut être réutilisée pour injecter des lamelles multiples, même si l'aiguille doit être remplacé lorsque l'on change le type d'ADN ou d'ARN qui est microinjectés. Une fois que l'aiguille est retirée de la baguette est doit être éliminé et non réutilisé.
   12. Les cellules mortes ou flottant parfois s'en tenir à la pointe de l'aiguille et peuvent interférer avec microinjection. Pour enlever ces débris de l'aiguille, relever l'aiguille du liquide en repoussant le pilier et puis, lentement, réinsérez le dos aiguille dans le liquide en réajustant le pilier à la position debout.
   13. Pour obtenir une mesure précise de la mesure de l'exportation cinétique de l'ARNm nucléaire, des échantillons distincts doivent être fixés à 0min, 15min, 30min, 60min et 120min après-ARN micro-injection, ou après α-amanitine traitement.

3. Fixation des cellules et coloration

1. Fixation cellulaire et de perméabilisation
   1. Au moment approprié, le milieu de croissance est aspiré et les cellules sont lavées deux fois avec 2 ml de solution PBS (NaCl 137mm, 2,7 mm de KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 2 mM KH ₂ PO _4, pH 7,4). Il est important de garder les lamelles humides en minimisant le temps qu'ils ne sont pas immergée dans un liquide.
   2. Les cellules sont fixées en ajoutant 2 ml de paraformaldéhyde à 4% (Sciences Electron Microscope) en PBS pendant au moins 15min à température ambiante.
   3. Les échantillons fixés sont lavées deux fois avec une solution PBS.
   4. Les cellules sont perméabilisées avec 2ml de 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant au moins 15 minutes à température ambiante.
   5. Les échantillons sont lavés deux fois avec une solution de PBS.
2. Coloration POISSONS
   1. Suivant les échantillons doivent être préparés pour l'hybridation. Les cellules sont lavées deux fois avec 1x SSC solution (150mm de NaCl, 15 mM de citrate de sodium, pH 7,0) avec 25-60% formimide. Pour la quantité de formamide, utilisez la même concentration qui est présent dans la solution d'hybridation (voir 3.2.3).
   2. Pour préparer la chambre de coloration, au fond d'un PetriDish 150mm est recouverte d'eau et un morceau de Parafilm est flottait sur l'eau. L'eau est éliminée en tournant le plat terminé, permettant ainsi à l'Parafilm d'adhérer au fond du plat. Les bulles d'air sont de nouveau manuellementdéplacé.
   3. Pour chaque lamelle d'être tachés, les gouttes 100 pi de la solution d'hybridation (25-60% de formamide, 100mg/ml sulfate de dextran, 1mg/ml E. coli ARNt, 5mM complexes riboside vanadyle en 1x SSC avec sonde dilué 1:500) sont pipetés sur le parafilm. Notez que la quantité de formamide devrait être optimisé pour la sonde FISH particulier utilisé.
   4. Avec l'aide de pinces, une lamelle est retiré d'un PetriDish 30mm, puis en utilisant du papier filtre Whatman (VWR) la face arrière (sans cellule côté) de la lamelle est tampons secs et l'excès est mauvais par la face avant sans sécher le fixe cellules. La lamelle est ensuite placée face vers le bas sur la solution FISH. Cette opération est répétée pour chaque lamelle.
   5. Après avoir placé le couvercle de la chambre coloration de retour sur, les échantillons sont incubés pendant 5-18hrs à 37 ° C.
3. Lavage et Montage du échantillons marqués
   1. Plusieurs chambres à laver sont faites de la même manière que la chambre de coloration (voir 3.2.2).
   2. Pour chaque lamelle, 1 ml de tampon de lavage (1x CSC avec le formamide 25-60%) est à la pipette sur la parafilm de la chambre de lavage. Encore une fois, utilisez la même concentration de formamide qui est présent dans la solution d'hybridation (voir 3.2.3).
   3. Pour enlever les lamelles de la chambre de coloration, 1ml de tampon de lavage est pipeté à côté de la lamelle. Le liquide doit être établi en dessous de chaque échantillon par action capillaire.
   4. En utilisant des pinces, les lamelles sont enlevées et chacune est placée sur la goutte de tampon de lavage et incubés à température ambiante pendant 5 min.
   5. Étapes 3.3.2 à 3.3.4 sont répétées deux fois plus, de sorte que chaque lamelle est lavé un total de 3 fois.
   6. Si l'ARN est d'être costained avec des protéines par immunofluorescence, voir la section 3.4.
   7. Les lames sont lavées avec 70% d'éthanol, et séché avec Kimwipes. Pour chaque lamelle, 10-30 ul de montage solution avec DAPI (Fluoromount G, Southern Biotech) est à la pipette sur les diapositives. Chaque diapositive peut accueillir deux lamelles.
   8. En utilisant des pinces et de papier-filtre Whatman, à l'arrière de la lamelle est séché et l'excès de liquide est mauvais sur le côté face de la lamelle sans sécher les échantillons. Chaque lamelle est ensuite placée face vers le bas, sur la goutte de la solution de montage.
   9. Échantillons peuvent être montés conserver à 4 ° C.
4. Immunofluorescence
   1. Les échantillons doivent être lavées deux fois avec du PBS pour éliminer le formamide qui peut interférer avec coloration des anticorps appropriés.
   2. Pour chaque lamelle, 50 pl de la solution d'anticorps primaire (anticorps 1.0μg/ml, 0,1% de TX-100, 0.1mg/ml RNAse free BSA dans du PBS) est à la pipette sur la parafilm d'une chambre de lavage.
   3. En utilisant des pinces, des lamelles sont placées côte à la cellule vers le bas sur la solution d'anticorps primaire et on laisse incuber à température ambiante pendant 30min.
   4. Pour chaque lamelle, deux gouttes 1ml de PBS sont à la pipette sur la parafilm d'une chambre de lavage.
   5. Pour enlever les lamelles de la solution de coloration des anticorps, 1ml de PBS est pipeté à côté de la lamelle. Le liquide doit être établi en dessous de chaque échantillon par action capillaire.
   6. En utilisant des pinces, les lamelles sont enlevées et chacun est placé sur la première goutte de PBS pendant 5 min, puis placé sur la deuxième baisse de PBS pour une autre 5min.
   7. Étapes 3.4.2 à 3.4.6 sont répétées en utilisant la solution d'anticorps secondaire fluorescent (anticorps 1.0μg/ml, 0,1% de TX-100, 0.1mg/ml BSA dans du PBS). Notez que depuis que le marqueur d'injection et de l'ARN sont visibles dans le canal vert et rouge, l'anticorps secondaire doit être conjugué à un colorant compatible comme Alexa647.
   8. Lamelles sont montées comme dans 3.3.7.

4. Imagerie et quantification

1. Imagerie
   1. Un microscope à épifluorescence est utilisé pour l'image des cellules après l'injection. Cellules injectées peuvent être situés en localisant les blessures de la Croix et l'identification des cellules avec un marqueur injecté (OG-dextran).
   2. Pour chaque cellule observée, une image de l'injection OG-dextran est acquis. Quand l'imagerie micro-injection d'ARNm, il est important que la quantification est limitée aux cellules qui ont reçu> 90% du fluide injecté (c. dextran) dans le noyau.
   3. Une image de l'ARN est alors acquise. Pour permettre la mesure précise de l'ARN, le temps d'exposition entre toutes les cellules dans un cours moment donné doit rester constante et comprise dans la plage dynamique de la caméra. Idéalement, chaque image doit inclure une cellule non-injecté afin de pouvoir calculer le bon fond de fluorescence intégrationnsity (voir 4.2.4).
   4. Pour aider à la quantification, une image de la tache DAPI peut également être acquis. Aussi, si l'immunofluorescence a été réalisée, la protéine peut également être teinté imagée. Un exemple de la distribution d'ARNm à différents points dans un cours du temps est montré dans la figure 4. L'ARNm codant pour une protéine sécrétée et est donc ciblée à l'urgence dans les cellules COS-7. Notez que l'ER-ciblage a été vérifiée par le co-marquage de l'ARN avec des anticorps contre TRAPα, une protéine résidente ER ^11.
2. Quantification
   
   Ceci peut être accompli avec un nombre de paquets d'image différents logiciels d'analyse. ImageJ logiciel est bien adaptée pour quantifier la distribution ARNm cellulaires car elle peut être utilisée pour séparer manuellement fractions nucléaire et cytoplasmique, il peut mesurer la fluorescence moyenne de ces fractions, et ses données de sortie peuvent être facilement copiées et collées dans d'autres logiciels, tels que Microsoft Excel.
   1. Images correspondantes pour les poissons, OG-dextran, et la fluorescence DAPI sont ouvertes et fusionnés à l'aide des images à Stack outil.
   2. Soit dans le DAPI ou le dextran couche de l'outil Seuil est utilisé pour isoler la zone correspondant au noyau microinjectés. Cette fraction est déterminée en utilisant l'outil Baguette, et après avoir déménagé à la couche FISH, la surface (A _Nuc) et la moyenne / moyenne intensité (F _Nuc) sont enregistrés en utilisant l'outil Mesurer.
   3. Le périmètre de cellules est décrit en utilisant l'outil de sélection à main levée, et tandis que sur la couche POISSONS la zone (A _Tot) et la moyenne / intensité moyenne (F _Tot) sont enregistrés en utilisant l'outil Mesurer. Si la fluorescence de votre cellule est nettement plus intense que celle de l'arrière-plan, vous pouvez utiliser l'outil Seuil au lieu de l'outil de sélection à main levée à l'aperçu de votre cellule souhaitée.
   4. En utilisant la fonction de sélection rectangulaire, une boîte est dessinée sur une cellule non-injecté et de l'intensité moyenne / moyenne (F _Retour) est enregistrée.
   5. Toutes les mesures sont copiés dans une feuille de calcul Excel.
   6. ARNm exporté est calculé selon l'équation suivante:
      
      

      A Nuc	Zone du noyau
      Un Doigt	Espace de la cellule entière
      F Nuc	Fluorescence moyenne de la fraction nucléaire
      F Tot	Fluorescence moyenne de la fraction de cellules entières
      F Retour	Fluorescence moyenne d'une cellule non transfectées

      
      Pour chaque point de temps à l'exportation% en moyenne est calculée et tracée au fil du temps.
   7. stabilité de l'ARNm est calculée en traçant la fluorescence ARNm total moyen (A x _{Tot (Tot} F - F _Retour)) au cours du temps. Typiquement, nous constatons que quantité d'ARNm varie grandement entre les cellules et entre les lamelles. Cela peut être dû à des incohérences entre les débits d'aiguille et entre l'efficacité de la coloration FISH.

Figure 1. Cellules lamelle microinjection. Sont cultivés jusqu'à ce qu'ils soient confluentes à 70-90%, puis blessé verticalement et horizontalement en utilisant un embout en plastique 200 pl pipette. A partir de la croix-blessure, les cellules sont injectées le long d'un bord de la plaie (flèche).

Figure 2. Régulateur de seringues. A) Schéma montrant comment le régulateur seringue est assemblé. B) Schéma de l'appareil assemblé. C) Une photographie du régulateur de seringues assemblées.

Figure 3. Effets de l'α-amanitine sur la transcription de l'ADN plasmidique injecté. NIH3T3 cellules fibroblastes, qui ont été pré-traitées avec différentes concentrationss des α-amanitine, ont été injectés avec des t-FTZ-Δi ADN plasmidique et OG-conjugués 70kD dextrane. Cellules injectées ont été incubées à 37 ° C pendant 1 heure, puis fixées et colorées pour les t-FTZ-Δi ARNm en utilisant un poisson spécifique probe6. Chaque ligne correspond à un seul champ de vision imagée pour les JO-70kDa dextrane et t-FTZ-Δi ARNm. Notez que haute, mais pas faible, des concentrations de médicaments totalement inhibé la production de t-FTZ-Δi transcription. Barre d'échelle = 15μm.

Figure 4. Bien entendu moment de l'exportation d'ARNm nucléaire. Cellules COS-7 ont été injectés avec des t-FTZ-Δi ADN plasmidique et OG-70kD conjugué dextrane. 30min après l'injection des cellules ont été traitées avec α-amanitine et incubées à 37 ° C pour les points de temps indiqué. Les cellules ont ensuite été fixées et colorées avec une sonde contre le t-FTZ-Δi ARNm et avec des anticorps contre le marqueur ER TRAPα. Chaque ligne correspond à un champ unique de cellules. Une distribution de l'ARNm), après une microinjection timecourse. B) Un coup de point de temps 120min de (A) montrant la co-localisation de t-FTZ-Δi ARNm et l'ER. Une superposition de l'ARNm t-FTZ-Δi (vert) et TRAPα (rouge) de coloration est montré dans le panneau de droite. Barres d'échelle = 15μm.

Discussion

La microinjection est un outil puissant qui peut être utilisé pour étudier un certain nombre de différents processus cellulaires. Contrairement à la transfection de cellules conventionnelles, la microinjection permet au chercheur d'introduire efficacement des acides nucléiques dans les noyaux cellulaires dans un délai très étroites. En conséquence, on peut effectuer des analyses cinétiques tels que la détermination des taux d'ARNm de l'exportation, la localisation d'ARNm et la synthèse des protéines. En outre, depuis le calendrier de l'expérience est relativement brève, on peut exposer des cellules à des composés toxiques dans les intervalles de temps courts, sans encourir des effets pléiotropes. Par ailleurs, les composés inhibiteurs ou stimulants tels que les protéines dominante négative, peut être co-injectées avec les acides nucléiques. Enfin, microinjections d'éviter l'obligation de réactifs de transfection, qui sont souvent toxiques pour les cellules et peuvent perturber les fonctions cellulaires différents.

ARNm vs injections d'ADN plasmidique

Le choix de l'acide nucléique à injecter dépendra d'un certain nombre de considérations. Après l'injection d'ADN plasmidique, l'ARN polymérase II non seulement synthétise l'ARNm, mais recrute aussi des facteurs protéiques de la transcription naissante ^12,13. Puisque ces facteurs régissent le traitement des événements tels que l'ARNm, l'exportation nucléaire et de la localisation cytoplasmique, les injections d'ADN plasmidique peut être utilisé pour évaluer la façon dont la transcription est couplée à des processus en aval. Bien que la transcription peut être couplé à l'exportation nucléaire ^14, nous avons constaté que l'ARNm injecté est exportée légèrement plus rapide que dans les ARNm transcrit in vivo ^6. Les raisons de ce ne sont pas claires pour le moment, mais ce résultat peut suggérer que l'ARNm nouvellement synthétisés se dégage de l'ARN polymérase II, il peut être immobilisé dans des complexes qui retardent l'exportation nucléaire.

Il ya certains avantages à des injections d'ARNm. Premièrement, le chercheur n'a pas à utiliser des inhibiteurs de l'ARN polymérase, qui pourrait affecter la façon dont les cellules réguler le métabolisme global de l'ARN. Deuxièmement, l'ARN peut être modifiée in vitro avant l'injection. Par exemple, les ARNm peuvent être synthétisés avec divers analogues de bouchon 5 'ou de poly (A) des longueurs de queue, afin d'évaluer comment ces caractéristiques affectent les exportations nucléaires ^6. Troisièmement, le montant exact de l'ARN qui est injecté peut être grossièrement estimé. En suivant le protocole décrit ci-dessus, nous estimons qu'environ 20.000 à 50.000 molécules sont injectées dans chaque noyau, qui est relativement faible comparé au nombre total de transcriptions dans une cellule de mammifère typique (400.000 à 850.000 molécules) ^15. L'inconvénient majeur avec des injections d'ARNm est que pendant la microinjection, une fuite du fluide d'injection dans le cytoplasme est inévitable. Depuis ARNm injecté directement dans le cytoplasme est stable sur de longues périodes (A. Palazzo, observation non publiée), des précautions supplémentaires doivent être prises pour sélectionner les cellules sont quantifiées. Généralement, nous analysons les cellules qui ont reçu> 90% de l'injection de fluide dans le noyau, tel qu'évalué par la distribution de l'OG-dextran.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tampon d'injection	Sigma-Aldrich		140 mM KCl et 10 mM HEPES, pH 7,4
Dextran Oregon Green 488-70 kD	Invitrogen	D7173	Un stock à 10 mg/ml dans le tampon d'injection peut être conservé longtemps à -80°C
Tubes capillaires en borosilicate	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Pointes de pipette de chargement pour aiguilles d'injection	Eppendorf	022351656
Microscope	Nikon Instruments	Eclipse Ti-S
Micromanipulateur	Narishige International	NT-88-V3MSH
Seringue pour injection	BD Biosciences	512311
Tampon PBS	Sigma-Aldrich		137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4
Tampon SSC	Sigma-Aldrich		150 mM NaCl, 15 mM citrate de sodium, pH 7,4
Parafomaldehyde à 4 %	Electron Microscopy Sciences	15686	Un stock de parafomaldehyde à 37 % est dilué dans le PBS
Triton X-100 à 0,1 % (Surfact-Amps)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	28314	Un stock de Triton X-100 à 10 % est dilué dans le PBS
Formamide	Fisher Scientific	F84-1
Sulfate de dextrane	Fisher Scientific	BP1585-100
E. coli ARNt	Sigma-Aldrich	R1753
Complexe ribosidique de vanadyle (VRC)	Sigma-Aldrich	R3380
Papier filtre Whatman	VWR international	28298-020
Table anti-vibrations	Kinetic Systems	5702E-3036-21
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-20
α-amanitine	Sigma-Aldrich	A2263
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12
Tireuse de micropipettes Flaming/Brown	Sutter Instrument Co.	P-97
Gras à vide	Dow Corning	695400008
ARN polymérase T7	New England Biolabs	M0251S
Poly(A) polymérase	Ambion	AM1350
Tampon d'hybridation	Sigma-Aldrich		100 mg/ml de sulfate de dextrane, 5 mM VRC, 150 mM NaCl, 15 mM citrate de sodium, 0,5 mg/ml d’E. coli ARNt, 60 % de formamide