Expression génique par électroporation de cellule unique dans des cultures de tranches d’hippocampe de souris

Résumé

Source : Keener, D. G., et al. Électroporation unicellulaire à travers différentes cultures de coupes organotypiques de neurones excitateurs et inhibiteurs spécifiques à la classe de souris. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo démontre le processus d’électroporation d’une cellule unique pour introduire de l’ADN plasmidique dans les neurones des cultures de tranches d’hippocampe de souris. La procédure implique un positionnement précis de la pipette, des ajustements de pression et des impulsions d’électroporation pour perméabiliser transitoirement la membrane neuronale, facilitant ainsi le transfert de gènes. Après électroporation, la tranche est incubée pour permettre l’expression du gène d’intérêt introduit.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Préparation de la culture de tranches

1. Préparez des cultures de tranches organotypiques d’hippocampe de souris comme décrit précédemment, en utilisant des souris postnatales de 6 à 7 jours de l’un ou l’autre sexe.
   1. Préparez un milieu de dissection pour la culture en coupe organotypique composé de (en mM) : 238 saccharose, 2,5 KCl, 1 CaCl₂, 4 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ et 11 glucose dans de l’eau désionisée, puis un gaz avec 5 % de CO₂/95 % O₂ jusqu’à un pH de 7,4.
   2. Prépare....

Résultats

Figure 1 : Deux images représentatives de pipettes en verre. (A) Affichez des pipettes à résistance inférieure (6,5 MΩ), utilisées dans ce protocole, et (B) des pipettes à résistance plus élevée (10,.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Préparation
plasmide Kit de purification de plasmide	Qiagen	12362
Préparation de culture en tranches organotypiques
	Binder	BD C150-UL
McIlwain Hachoir à tissus	TED PELLA, INC.	10180	Hachoir à tissus pour la préparation de la culture de coupes organotypiques
Insert de culture cellulaire Millicell, 30 mm	Inserts	de culture de PIHP03050	de coupes organotypiques
Osmometer	Precision Systems	OSMETTE II
	Cole-Parmer	SK-06369-11
Ciseaux	FST	14958-09
Stéréomicroscope	Olympus	SZ61
Système de filtration sous vide stérile	Millipore	SCGPT01RE	Filtration et stockage d’un LCR
Préparation d’électrodes Verres
capillaires	Warner Instruments	640796
Micropipetter Extracteur	Sutter Instrument	P-1000	Extracteur
Four	Liant	BD (E2)
Extracteur Filament	Sutter Instrument	FB330B	Extracteur
Électroporation
3,5 mm Falcon Petri Antennes paraboliques	BD Falcon	353001
Airtable	TMC	63-7512E
Système d’électroporation	Dispositifs moléculaires	Axoporator 800A	Électroporateur

de 6 Plaques à puits GREINER BIO-ONE 657160 Dumont #5/45 Pince FST#5/45 Pince à dissection coudée pour la préparation de la culture en tranches organotypiques Unité de filtration en flacon Millipore SCHVU02RE Filtration et stockage des milieux de culture Incubateur Spatules revêtues de PTFE monocellulaire