Expression génique par électroporation de cellule unique dans des cultures de tranches d’hippocampe de souris

Résumé

Source : Keener, D. G., et al. Électroporation unicellulaire à travers différentes cultures de coupes organotypiques de neurones excitateurs et inhibiteurs spécifiques à la classe de souris. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo démontre le processus d’électroporation d’une cellule unique pour introduire de l’ADN plasmidique dans les neurones des cultures de tranches d’hippocampe de souris. La procédure implique un positionnement précis de la pipette, des ajustements de pression et des impulsions d’électroporation pour perméabiliser transitoirement la membrane neuronale, facilitant ainsi le transfert de gènes. Après électroporation, la tranche est incubée pour permettre l’expression du gène d’intérêt introduit.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Préparation de la culture de tranches

1. Préparez des cultures de tranches organotypiques d’hippocampe de souris comme décrit précédemment, en utilisant des souris postnatales de 6 à 7 jours de l’un ou l’autre sexe.
   1. Préparez un milieu de dissection pour la culture en coupe organotypique composé de (en mM) : 238 saccharose, 2,5 KCl, 1 CaCl₂, 4 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ et 11 glucose dans de l’eau désionisée, puis un gaz avec 5 % de CO₂/95 % O₂ jusqu’à un pH de 7,4.
   2. Préparez un milieu de culture en coupe organotypique composé de : 78,8 % (v/v) de milieu essentiel minimum Eagle, 20 % (v/v) de sérum de cheval, 17,9 mM de NaHCO₃, 26,6 mM de glucose, 2 M de CaCl₂, 2 M de MgSO₄, 30 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-1-éthanesulfonique (HEPES), d’insuline (1 μg/mL) et 0,06 mM d’acide ascorbique, pH ajusté à 7,3. Ajustez l’osmolarité à 310-330 osmol à l’aide d’un osmomètre.
   3. Disséquez l’hippocampe de tout le cerveau à l’aide de deux spatules et coupez-le (400 μm) à l’aide d’un hachoir à tissus. Séparez les tranches à l’aide de deux pinces et transférez-les dans des inserts de culture cellulaire de 30 mm dans une plaque à 6 puits remplie de milieu de culture (950 μL) sous les inserts.
2. Conservez les cultures en tranches organotypiques dans un incubateur de culture tissulaire (35 °C, 5 % CO₂) et changez le milieu de culture en tranches tous les deux jours.

2. Préparation du plasmide

1. Préparez le plasmide pour le gène d’intérêt.
   1. Sous-clonez le gène EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) dans un vecteur pCAG.
   2. Purifier le plasmide pCAG-EGFP à l’aide d’un kit de purification exempt d’endotoxines et le dissoudre dans une solution interne composée d’eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle contenant 140 mM de K-méthanesulfonate, 0,2 mM d’acide tétraacétique d’éthylène glycol (EGTA), 2 mM de MgCl₂ et 10 mM d’HEPES, ajustée à pH 7,3 avec KOH (concentration du plasmide : 0,1 μg/μL).

3. Préparation des pipettes en verre

1. Tirez les pipettes en verre borosilicate (4,5 – 8 MΩ) sur un extracteur de micropipettes (Figure 1A).
   REMARQUE : Les pipettes en verre utilisées pour les enregistrements de pinces de patch à cellules entières sont idéales pour l’électroporation.
2. Faites cuire les pipettes en verre pendant la nuit à 200°C pour les stériliser.
3. Vérifiez la taille de la pointe de la pipette à l’aide d’un microscope de dissection pour estimer la résistance électrique.
   1. Facultatif :Vérifiez la résistance de la pipette en fixant la pipette à l’électrode d’électroporation et utilisez le micromanipulateur pour manœuvrer la pointe de la pipette dans du liquide céphalo-rachidien artificiel stérilisé par filtre (aCSF) contenant (en mM) : 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl₂, 5 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ et 11 glucose dans de l’eau désionisée, gazée avec 5 % de CO₂/95 % O₂ à un pH de 7,4. Confirmez la résistance réelle à l’aide de l’affichage sur l’electroporator.
      REMARQUE : Plus la pointe de la pipette est pointue, plus la résistance électrique est importante. La résistance de la pipette doit être inférieure à 10 MΩ. Les pipettes en verre à haute résistance (Figure 1B) se bouchent souvent à l’extrémité lors d’électroporations répétées.

4. Configuration du dispositif d’électroporation

1. Installez l’électroporateur dans un appareil d’électrophysiologie standard à cellules entières, équipé d’un microscope vertical monté sur une table mobile, d’un micromanipulateur et d’une pompe péristaltique.
2. Installez l’étage supérieur de l’électroporateur sur un micromanipulateur et connectez une paire de haut-parleurs à l’électroporateur. Connectez l’électroporateur à une pédale qui peut être utilisée pour envoyer une impulsion lorsqu’elle est prête.
   REMARQUE : Les haut-parleurs émettent une tonalité lorsqu’ils sont allumés, ce qui est un indicateur de la résistance électrique au niveau de l’électrode. Cela permet de déterminer les changements relatifs de résistance sans détourner l’attention de la procédure.

5. Préparation par électroporation

1. Transférez les inserts de culture en tranches des plaques à 6 puits vers des boîtes de Pétri de 3 cm chargées de 900 μL de milieux de culture et stockées dans un incubateur à CO₂ de table jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à effectuer l’électroporation.
   1. Préincuber des inserts de culture frais avec un milieu de culture en tranches (1 mL) pendant au moins 30 minutes dans une boîte de Pétri de 3,5 cm pour cultiver les tranches après électroporation.
2. Nettoyez et préparez la plate-forme pour l’électroporation.
   1. Perfuser les lignes avec de l’eau de Javel à 10 % pendant 5 min pour stériliser le tube et la chambre avant de commencer l’expérience pour la journée.
   2. Perfuser les conduites avec de l’eau autoclavée désionisée pendant au moins 30 minutes pour rincer complètement.
   3. Perfuser les lignées avec de l’aCSF stérilisé par filtre contenant 0,001 mM de tétrodotoxine (TTX).
      REMARQUE : Le TTX minimise la toxicité cellulaire et la mort due à la surexcitation des interneurones.
3. Réglez les paramètres d’impulsion de l’électroporateur : amplitude de 5 V, impulsion carrée, train de 500 ms, fréquence de 50 Hz et largeur d’impulsion de 500 μs.
4. Remplissez la pipette en verre avec 5 μL de solution interne contenant du plasmide.
   1. Retirez toutes les bulles d’air emprisonnées de la pointe de la pipette en effleurant et en tapotant doucement la pointe plusieurs fois.
   2. Vérifiez que la pointe n’est pas endommagée en la visualisant sous un microscope de dissection ou en répétant l’étape 3.3.1 pour vérifier la résistance de la pipette.
      REMARQUE : Si la pointe est endommagée, la pipette en verre doit être jetée, et cette étape doit être répétée avec une nouvelle pipette en verre préalablement préparée à l’étape 3.
5. Fixez solidement la pointe de la pipette à l’électrode et allumez les haut-parleurs. Enregistrez la lecture (résistance de la pipette) de l’électroporateur lorsque la pointe est entrée en contact avec le milieu aCSF.
6. Coupez la membrane de l’insert de culture à l’aide d’une lame tranchante et isolez une tranche de culture. Transférez avec précaution la culture de tranches dans la chambre d’électroporation à l’aide d’une pince à angle vif et fixez sa position à l’aide d’un ancrage de tranche.
   1. Ne gardez pas la culture de tranche à l’extérieur de l’incubateur pendant plus de 30 minutes à la fois pour prévenir les effets secondaires tels que les changements dans la santé ou la fonction neuronale.

6. Cellules électroporatiques d’intérêt

1. Appliquez une pression positive sur la pipette à l’aide de la bouche ou à l’aide d’une seringue de 1 mL (pression de 0,2 à 0,5 mL) fixée à la tubulure.
2. Utilisez les commandes à bouton 3 dimensions du micromanipulateur pour manœuvrer la pointe de la pipette près de la surface de la culture en tranches.
3. Choisissez une cellule cible et approchez-vous-en, en maintenant la pression positive appliquée jusqu’à ce qu’une fossette se forme à la surface de la cellule visible au microscope.
4. Effectuez des cycles de pression.
   1. Appliquez rapidement une légère pression négative par la bouche afin qu’un joint lâche se forme entre la pointe de la pipette et la membrane plasmique, indiqué visuellement par la membrane remontant quelque peu dans la pointe de la pipette. Observez une augmentation (~2,5 fois la résistance initiale) de la résistance de la pipette en écoutant une augmentation de la tonalité provenant des haut-parleurs. Réappliquez rapidement une pression positive pour que la fossette se reforme.
   2. Effectuez immédiatement au moins deux autres cycles de pression sans faire de pause, puis maintenez une pression négative pendant 1 s.
      REMARQUE : Faire une pause entre les cycles, appliquer trop de pression ou maintenir la pression négative trop longtemps peut causer des dommages importants à la cellule et éventuellement provoquer la mort de la cellule pendant l’électroporation.
5. Pulsez rapidement l’électroporateur une fois à l’aide de la pédale lorsque la tonalité des haut-parleurs atteint un sommet stable en hauteur, indiquant une résistance électrique maximale. N’attendez pas plus de 1 s à la résistance de crête avant d’envoyer l’impulsion.
   REMARQUE : Nous n’avons observé aucune électroporation hors cible lors de l’utilisation de ce protocole. Seules les cellules en contact avec la pipette en verre pendant les cycles de pression ont été transfectées. Le positionnement de la pipette à proximité d’autres neurones n’entraîne pas de transfection de gènes.
6. Rétractez doucement la pipette à environ 100 μm de la cellule sans appliquer de pression.
7. Réappliquez une pression positive, en vérifiant que la résistance est similaire à la lecture enregistrée à l’étape 5.5, puis approchez-vous de la cellule suivante.
   >
   1. Éliminez les obstructions potentielles, indiquées visuellement ou par une résistance de pipette considérablement accrue (>15 % plus élevée) après électroporation, en appliquant une pression positive.
      >REMARQUE : S’il n’y a pas de obstruction visible et que la résistance est encore nettement plus élevée, jetez la pipette et utilisez-en une neuve. En moyenne, une pipette peut être utilisée pour jusqu’à 20 événements d’électroporation si l’utilisateur est prudent.
8. Après l’électroporation, transférez la culture en tranches sur un insert de culture frais et incubez à 35°C dans l’incubateur jusqu’à 3 jours.

Résultats

Figure 1 : Deux images représentatives de pipettes en verre. (A) Affichez des pipettes à résistance inférieure (6,5 MΩ), utilisées dans ce protocole, et (B) des pipettes à résistance plus élevée (10,...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Préparation
plasmide Kit de purification de plasmide	Qiagen	12362
Préparation de culture en tranches organotypiques
	Binder	BD C150-UL
McIlwain Hachoir à tissus	TED PELLA, INC.	10180	Hachoir à tissus pour la préparation de la culture de coupes organotypiques
Insert de culture cellulaire Millicell, 30 mm	Inserts	de culture de PIHP03050	de coupes organotypiques
Osmometer	Precision Systems	OSMETTE II
	Cole-Parmer	SK-06369-11
Ciseaux	FST	14958-09
Stéréomicroscope	Olympus	SZ61
Système de filtration sous vide stérile	Millipore	SCGPT01RE	Filtration et stockage d’un LCR
Préparation d’électrodes Verres
capillaires	Warner Instruments	640796
Micropipetter Extracteur	Sutter Instrument	P-1000	Extracteur
Four	Liant	BD (E2)
Extracteur Filament	Sutter Instrument	FB330B	Extracteur
Électroporation
3,5 mm Falcon Petri Antennes paraboliques	BD Falcon	353001
Airtable	TMC	63-7512E
Système d’électroporation	Dispositifs moléculaires	Axoporator 800A	Électroporateur

de 6 Plaques à puits GREINER BIO-ONE 657160 Dumont #5/45 Pince FST#5/45 Pince à dissection coudée pour la préparation de la culture en tranches organotypiques Unité de filtration en flacon Millipore SCHVU02RE Filtration et stockage des milieux de culture Incubateur Spatules revêtues de PTFE monocellulaire