Manipulation optogénétique de circuits neuronaux pour la transition du sommeil à l’éveil chez la souris

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Chirurgie animale, injection de virus, électrode pour EEG/EMG et implantation de fibres optiques

ATTENTION : Les techniques de protection et de manipulation appropriées doivent être sélectionnées en fonction du niveau de biosécurité du virus à utiliser. Le virus adéno-associé (AAV) doit être utilisé dans une pièce d’injection isolée classée P1A, et le tube porteur de l’AAV doit être stérilisé avec un autoclave une fois que tout le volume est épuisé. Le site chirurgical et tout le matériel implanté doivent être propres et stériles pendant l’utilisation.

REMARQUE : Voir Figure 1.

1. Désinfectez le matériel chirurgical avec l’autoclave.

2. Anesthésisez les souris avec de l’isoflurane à l’aide d’un vaporisateur anesthésique. Observez jusqu’à ce que la souris ait atteint la profondeur d’anesthésie souhaitée, déterminée par la perte de réponse au pincement de la queue avec des pinces. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter qu’ils ne se dessèchent.

3. Désinfectez le champ opératoire avec une solution iodée ou de l’éthanol à 70 % (EtOH, 3x) et séchez-le suffisamment. Laissez le virus décongeler sur de la glace pendant que la chirurgie est effectuée. Couvrez la zone chirurgicale avec du papier de laboratoire absorbant

4. Fixez la tête de la souris dans l’appareil stéréotaxique avec des barres d’oreille et un pincement du nez. Après avoir confirmé que la tête est maintenue de manière stable, faites une incision médio-sagittale dans le cuir chevelu pour vous assurer que les positions du bregma et du lambda sont situées au même niveau sur une ligne horizontale.

5. Pour éviter un écart de positionnement, ajustez correctement les niveaux du pincement nasal et des barres d’oreille de haut en bas. Le bregma et le lambda font référence à l’intersection entre la sutura saggitalis et la sutura coronalis ou la sutura lambdoidal, respectivement (Figure 2).

6. Utilisez des pinces Serafin pour maintenir la peau afin de maintenir l’accès au crâne. Après exposition du crâne, désinfectez la surface du crâne avec de l’iode ou 5 %_H2O₂, pour permettre de visualiser plus clairement les sutures crâniennes, y compris le bregma et le lambda.

7. Préparez l’injection vectorielle AAV :

1. Lavez l’intérieur d’une seringue de 10 ml (voir le tableau des matières) séquentiellement avec 70 % d’EtOH, 100 % d’EtOH et de l’eau stérilisée, 5 fois chacun. Fixez la seringue dans la pince d’un bras de pompe de micro-injection et assurez-vous que toute la solution contenue dans la seringue est évacuée.

2. Aspirez soigneusement 2 μL d’huile minérale sans bulles d’air, puis aspirez le volume désigné de la solution virale. Après l’aspiration, manipulez le bouton du piston et confirmez que la solution virale émerge à la pointe de l’aiguille.

REMARQUE : Le volume d’injection de la solution virale a été déterminé dans le cadre d’expériences pilotes utilisant la même souche de souris et le même produit viral. La relation entre le volume de la solution virale et l’étendue de la zone d’infection doit être estimée à l’avance.

8. Injectez AAV vector :

1. Ajustez la pointe de l’aiguille de micro-injection sur le bregma et notez les coordonnées comme point d’origine. Déplacez l’extrémité vers le site d’injection désigné (pour le BNST : antéropostérieure + 0,2 mm, médiolatérale ± 1,0 mm, dorso-ventrale - 4,2 mm) et placez la pointe de l’aiguille dans cette position. Mettez une marque sur le crâne et percez des trous d’environ 2 mm de diamètre à l’aide d’une perceuse dentaire avec une fraise en carbure de 0,7 mm. Attention à ne pas endommager la dure-mère ou le tissu cérébral.

2. Après avoir retiré le sang autour des trous avec un coton-tige, déplacez lentement l’aiguille dans la position du BNST. Injectez lentement la quantité désignée de solution virale (0,07 μl/min) à l’aide d’un micro-injecteur mécanique. Une fois l’injection terminée, laissez l’aiguille pendant 5 minutes pour permettre à la solution de s’infiltrer suffisamment dans le tissu BNST. Retirez délicatement l’aiguille.

3. Pour les injections bilatérales, répétez les étapes 1.8.1-1.8.2 de l’autre côté. Tout au long de la procédure, appliquez une solution saline stérile pour garder le crâne humide.

REMARQUE : Nous avons utilisé des implants d’électroencéphalographie (EEG)/électromyographie (EMG) personnalisés (largeur : 5 mm, profondeur : 7 mm, hauteur : 1 mm) avec quatre électrodes EEG (4 mm), deux électrodes EMG (2 mm ; coupez l’électrode de 4 mm à 2 mm avec une pince) et 6 électrodes (4,5 mm) (Figure 2A).

9. Soudez deux fils d’acier inoxydable (voir tableau des matériaux) dont 1 mm d’isolant est dénudé des deux extrémités des électrodes EMG. Ajustez le centre des électrodes sur le bregma, marquez la position de chaque électrode EEG (antéropostérieure ± 1,5 mm, médiolatérale ± 1,0 mm) et déterminez la position de l’implant (Figure 2B).

10. Implanter les fibres optiques :

1. Fixez une virole à fibre optique au manipulateur et faites pivoter le bras du manipulateur de manière à ce qu’il ait un angle de ±30° par rapport à une ligne horizontale (ce processus n’est nécessaire que pour éviter les interférences entre les électrodes et les fibres optiques, comme dans le cas de la stimulation BNST). Placez l’embout de la fibre sur le bregma et notez les coordonnées.

2. Déplacez la pointe sur la ligne d’insertion ciblée et marquez la position sur le crâne. Placez également des marques supplémentaires près du site d’insertion des vis d’ancrage. Percez le crâne sur chaque site avec une perceuse dentaire pour insérer la fibre optique et fixer la vis. Fixez la vis sur le crâne. Veillez à ne pas casser la dure-mère ou à n’endommager aucun tissu avec la vis.

3. Insérez doucement la fibre optique jusqu’à ce qu’elle atteigne au-dessus du BNST avec un manipulateur. La virole doit reposer sur le crâne restant (Figure 1B).

4. Appliquez du ciment dentaire photodurcissable (voir le tableau des matériaux) pour couvrir la fibre et la vis. Le temps de réaction pour solidifier la colle doit être spécifié par le manuel du fabricant (Notre matériau nécessite une exposition à la lumière pendant au moins 10 secondes avec des photo-générateurs de longueurs d’onde spécifiques. Il n’est pas nécessaire de sécher la colle après cela).

5. Dans cette étape, assurez-vous qu’aucun matériau (vis ou colle) n’occupe l’espace de montage des électrodes. De plus, évitez de faire toute interruption dans le ciment pour la virole reliant la fibre optique et le câble. Répétez les étapes 1.10.1 à 1.10.4 du côté opposé pour une stimulation bilatérale.

11. Percez des trous pour les électrodes EEG/EMG. Insérez les pointes des électrodes dans les trous. Tenez l’implant et appliquez un adhésif cyanoacrylate dans l’espace entre le crâne et les électrodes. Insérez-le à nouveau en faisant attention à ne pas interférer avec les matériaux.

12. Couvrez la circonférence des électrodes et des fibres optiques avec un adhésif cyanoacrylate, suivi de l’application d’un accélérateur cyanoacrylate sur l’adhésif. Cette étape permet d’éviter de provoquer une interruption au niveau de la zone de connexion virole-câble optique et électrode-fil (Figure 1C).

REMARQUE : L’adhésif cyanoacrylate et son accélérateur sont nocifs pour l’œil de la souris. Faites attention à ne pas provoquer de déversement de ces substances chimiques. Veillez également à ne pas toucher fortement les électrodes et les fibres afin d’éviter une déviation inattendue immédiatement après la solidification de l’adhésif.

13. Exposez les muscles du cou de la souris et insérez les fils de l’électrode EMG sous le muscle. Ajustez la longueur de l’électrode EMG de manière à ce qu’elle soit située juste sous les muscles nucaux. Une connexion légère entre l’extrémité de l’électrode et le fascia musculaire suffit à capter le signal EMG.

14. Appliquez un adhésif cyanoacrylate pour remplir les implants et solidifiez l’adhésif avec un liquide d’accélération. Ensuite, placez la souris sur un coussin chauffant pour récupérer jusqu’à ce que le réflexe postural apparaisse. Ajustez la température du coussin chauffant à la température corporelle de l’animal au repos (36,0 °C en ZT 0-12 dans le cas des souris C57BL6 ; ne dépassez pas 38,0 °C).

REMARQUE : Un antibiotique n’est pas nécessaire pour la chirurgie stérile. Suivez les directives de votre établissement local pour l’analgésie postopératoire. Gardez les souris dans une cage domestique pendant une période de récupération d’au moins 7 jours.

2. Surveillance EEG/EMG avec photo-excitation de neurones ciblés dans des états de sommeil spécifiques

ATTENTION : Ce protocole comprend l’utilisation d’un équipement laser de classe 3B ou de dispositifs LED. Les expérimentateurs doivent être conscients des informations de sécurité. Des lunettes de protection sont nécessaires.

1. Avant de connecter le câble laser à la fibre optique, ajustez l’intensité du laser à l’aide d’un détartreur. Attachez l’extrémité du câble laser à une fibre optique inutilisée à l’aide d’une virole et vérifiez qu’il n’y a pas d’espace à la jonction entre la fibre et le câble.

2. Allumez l’interrupteur principal du laser et attendez 20 minutes qu’il se réchauffe.

3. Émettez le laser sur le vérificateur d’intensité et ajustez l’intensité du laser à 10 mW/mm². Passez en mode laser à transistor et vérifiez que les impulsions lumineuses sont émises par la fibre contrôlée par le régulateur de motif, qui est réglé à 10 ms pour la durée, 40 ms pour le repos, 20 fois pour le cycle et 20 fois pour la répétition (c’est-à-dire 20 Hz d’impulsions lumineuses de 10 ms pendant 20 s).

4. Après la période de récupération, déplacez les souris dans la chambre expérimentale pour l’enregistrement de l’EEG/EMG. Les souris domestiques ont été maintenues à une température constante de 23 °C avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures, avec de la nourriture et de l’eau disponibles à volonté.

5. Connectez l’électrode implantée et l’adaptateur de câble qui est attaché à une bague collectrice pour éviter l’enchevêtrement. Il est recommandé de couvrir la jonction avec un matériau imperméable à la lumière tel qu’une feuille d’aluminium pour éviter les fuites de laser. Si une expérience bilatérale est nécessaire, utilisez une bague collectrice avec une fixation bifurquée pour les câbles.

6. Dans ce protocole, nous évaluons la latence à l’éveil du sommeil à mouvements oculaires non rapides (NREM) ou du sommeil paradoxal, de sorte que le temps d’enregistrement doit être limité dans le temps de zeitgeber optimisé (ZT0 est défini comme le temps pendant lequel la lumière est allumée). Ce protocole a été mis en œuvre entre ZT4 et ZT10. Laissez les souris rester librement dans la chambre d’expérimentation pendant au moins 1 h comme acclimatation.

7. Pendant la période expérimentale, surveillez les signaux EEG et EMG sur le même moniteur et évaluez l’état de la souris comme l’éveil, le sommeil NREM ou le sommeil paradoxal. Utilisez la commande de gain pour chaque onde afin de faciliter la distinction de chaque état.

8. Pour mesurer la latence du sommeil NREM à l’éveil, observez le sommeil NREM stable pendant 40 secondes ou le sommeil paradoxal stable pendant 30 s, puis allumez l’interrupteur du générateur de motifs pour la photostimulation (ce protocole génère 20 Hz d’impulsions lumineuses de 10 ms pendant 20 s). Confirmez l’émission laser vers les fibres optiques implantées.

9. Enregistrez les signaux EEG/EMG jusqu’à ce que l’état de sommeil se transforme en état d’éveil. Si deux essais expérimentaux ou plus sont nécessaires, limitez la manipulation optogénétique à une fois par jour, car la photostimulation est une intervention artificielle qui pourrait affecter l’architecture du sommeil et de l’éveil.

10. Après l’expérience, anesthésier profondément et perfuser avec une solution saline stérile et du paraformaldéhyde (PFA) pour prélever l’ensemble du cerveau pour une analyse immunohistochimique.

Figure 1 : Procédure d’injection d’AAV, de fibres optiques implantaires et d’implants EEG/EMG. (A) Procédure expérimentale d’injection de virus. Le gène ChR2 ou EYFP (pour contrôle) incorporé dans un vecteur AAV dont la transcription est activée par la Cre recombinase a été injecté bilatéralement dans le BNST. (B) Les fibres optiques ont été insérées vers le BNST à un angle de 30° par rapport à l’horizontale pour éviter toute collision avec l’électrode. Deux vis ont été insérées autour de celui-ci. (C) Un appareil d’enregistrement EEG/EMG a été implanté après la mise en place sécurisée des fibres optiques. (D) À la fin de l’opération, toute la zone chirurgicale doit être recouverte d’un adhésif cyanoacrylate et solidement fixée. Assurez-vous de ne pas appliquer d’agent sur la région reliant l’électrode et les embouts.

Figure 2 : Sites d’insertion personnalisés des électrodes EEG/EMG et des broches d’électrode. (A) En haut : Sur 6 broches d’électrode, les deux broches externes sont coupées à 2 mm. En bas : électrodes EEG/EMG. (B) Ces électrodes et fils de conduction EMG sont ensuite soudés. La zone de connexion doit être isolée avec un isolant, comme un adhésif cyanoacrylate. Les sites d’insertion des électrodes sont relatifs au bregma (antéropostérieur ± 1,5 mm, médiolatéral ± 1,0 mm). Les fils EMG sont insérés sous le muscle du cou avec le retrait de l’isolant protégeant le fil au site d’insertion (1 mm).