Transfert de gènes médié par un virus dans le noyau cochléaire dorsal de souris pour une stimulation auditive induite par la lumière

Résumé

Source : Kozin, E. D., et.al. Visualisation directe du noyau cochléaire dorsal murin pour la stimulation optogénétique de la voie auditive. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo démontre le transfert de gènes médié par le virus dans le noyau cochléaire dorsal (DCN) de souris pour permettre la stimulation auditive induite par la lumière. Un vecteur viral codant pour l’opsine, un canal ionique sensible à la lumière, est injecté dans le DCN à la suite d’une craniotomie et d’une aspiration cérébelleuse pour un accès direct. Les opsines exprimées permettent aux neurones d’être activés par la lumière, fournissant un modèle pour étudier les réponses des voies auditives à l’aide de l’optogénétique.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Aspiration cérébelleuse

1. À l’aide d’une aspiration à 5 français, aspirez la partie la plus latérale du cervelet gauche recouvrant le DCN jusqu’à ce que le DCN soit visuel (Figure 1, panneau de droite). Retirez environ 1/4 à 1/3 du cervelet gauche. Le principal point de repère adjacent à la DCN est l’ampoule du canal semi-circulaire supérieur.
   REMARQUE : L’aspiration du cervelet est l’étape clé du protocole. L’aspiration dirigée du cervelet est plus réussie si elle se produit en une seule tentative et non avec plusieurs passages d’aspiration, car cela provoquerait des saignements. Pour faciliter l’aspiration, réglez le plan focal du microscope à la profondeur prévue du CN, qui sera légèrement distale par rapport à la surface du cervelet. Le réglage du plan focal sur le CN améliorera la visualisation et garantira une image nette.
2. Après l’aspiration, d’autres saignements, une accumulation de liquide céphalo-rachidien (LCR) et un déplacement du cervelet sur le DCN sont attendus. Instillez rapidement 0,5 cc de solution saline stérile dans la craniotomie pour prévenir la coagulation sanguine. Une combinaison de tamponnage doux avec un point dentaire et d’aspiration peut ensuite être utilisée pour dégager un chemin pour une visualisation directe du DCN. N’entrez pas en contact direct avec la surface du DCN.

2. Microinjection sous pression pour le transfert de gènes médié par le virus et la récupération chirurgicale

1. Une fois que le DCN est exempt de sang et de LCR sus-jacents et qu’il est clairement visible, effectuez des micro-injections de pression dans le DCN à l’aide d’une seringue Hamilton de 10 μl sur une période de 2 minutes.
2. Introduisez l’aiguille à l’aide d’un micromanipulateur jusqu’à ce que la pointe ne soit plus visible sous la surface du DCN.
3. Pour des performances optimales, utilisez une aiguille de calibre 33 ou 34 (utilisez une seringue étanche au gaz avec l’aiguille de calibre 34) avec un biseau peu profond, par exemple à 45°, pour minimiser les traumatismes contondants et localiser le volume d’injection dans le DCN, qui est une structure mince et peu profonde du tronc cérébral (<300 μm d’épaisseur).
   REMARQUE : D’autres instruments de micro-injection peuvent être utilisés. Idéalement, l’instrument d’injection doit être suffisamment flexible pour permettre une légère flexion si nécessaire pour cibler directement le DCN. De plus, comme la souris se déplace légèrement tout au long de la procédure en raison de la respiration, l’instrument doit être suffisamment robuste pour résister à des mouvements mineurs.

3. Récupération chirurgicale

1. Immédiatement après l’injection, rapprochez à nouveau la peau et permettez à la souris de récupérer selon la procédure de récupération standard. Le cervelet restant et le tissu cicatriciel rempliront la cavité causée par l’aspiration du cervelet. Surveillez constamment les animaux jusqu’à ce qu’ils retrouvent une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Surveillez votre fréquence cardiaque, votre fréquence respiratoire ainsi que votre capacité à vous nourrir.
   REMARQUE : Aucun animal ayant subi une intervention chirurgicale n’est renvoyé dans une cage avec d’autres animaux avant d’être complètement rétabli.
2. Si une souris commence à tourner en rond après l’opération (<5 % des cas), généralement 2 à 4 heures après la fermeture de l’incision cutanée, sacrifiez immédiatement la souris, car elle aurait probablement du mal à se nourrir. Cet effet secondaire est probablement dû à l’aspiration du cervelet. L’animal doit faire l’objet d’une surveillance postopératoire et l’administration de narcotiques appropriés doit assurer son confort conformément aux normes institutionnelles. Des antibiotiques peuvent être nécessaires, si des signes d’infection.

Résultats

Figure 1 : L’aspiration cérébelleuse partielle démontre l’accès au noyau cochléaire dorsal. Panneau gauche : Une fois la souris placée dans le support, une incision est pratiquée verticalement à travers la peau et les tissus mous le lo...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Support stéréotaxique	Stoelting	51500
5	suction Symmetry Surgical	2777914
Dental Points	Henry Schein	100-8170
Bone rongeur	Fine Surgical Tools	16020-14
10 μl Seringue Hamilton	Hamilton	7633-01
34 gauge, needle	Hamilton		207434
Outils chirurgicaux fins	Rongeurs	16021-14

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