Régénération axonale du nerf sciatique d’une souris suite à une blessure par écrasement

1. Matériaux et réactifs

1. Animaux
   Utilisez des
   1. souris CF1 femelles de six semaines pesant 30–35 g pour les expériences.
      NOTE : Les souris ont été logées en groupe (5 souris par cage) dans des cages stérilisées ventilées individuellement avec une litière en épis de maïs de 1/4 » et des nids carrés de 2 » pour la nidification. Les cages ont été maintenues selon un cycle contrôlé de 12 heures entre la lumière et l’obscurité et la température ambiante se situait entre 19,4 °C et 25 °C. Les souris ont été nourries avec un régime alimentaire mondial pour rongeurs et un système d’approvisionnement automatique en eau.
2. Instruments
   1. Utilisez les instruments chirurgicaux suivants pour effectuer efficacement l’opération : seringues jetables (27 G, 1,0 mL) pour injection intrapéritonéale, tondeuse à fourrure, microscope à dissection stéréoscopique, pinces de microchirurgie, ciseaux de microchirurgie, petits rongeurs osseux et éponges non tissées stérilisées.
      REMARQUE : Tous les instruments et matériaux sont autoclavés avant l’intervention chirurgicale ou pré-stérilisés par les fabricants. Pendant l’opération, les instruments sont pulvérisés avec de l’alcool à 75 % pour maintenir la stérilité.
3. Solutions anesthésiques
   1. Utilisez la solution anesthésique #1 pour induire l’anesthésie et utilisez la solution d’anesthésie #2 avant l’injection des ganglions de la racine dorsale (DRG) pour maintenir l’anesthésie.
      1. Pour faire la solution anesthésique #1, diluez la kétamine et la xylazine dans une solution saline stérile à une concentration finale de 10 mg/mL et 1,2 mg/mL.
      2. Pour faire la solution anesthésique #2, diluez l’avertin dans une solution saline stérile à une concentration finale de 20 mg/mL.
4. Plasmide d’ADN et ARN Oligos
   1. Préparez les plasmides à l’aide du kit commercial en suivant les protocoles du fabricant en conséquence. Diluer les ADN plasmidiques dans de l’eau désionisée stérile à la concentration de 2,0 μg/μL.
   2. Ajouter la solution de colorant Fast Green pour atteindre une concentration finale de 0,005 à 0,01 % (v/v) pour une meilleure visualisation du contour du DRG pendant l’injection.
   3. Dissoudre les petits ARN interférents (siRNA) ou les oligonucléotides de microARN (oligos de microARN) dans les tampons correspondants fournis par les fabricants pour atteindre une concentration finale de 50 μM.
5. Pipette de micro-injection
   1. Tirez le verre capillaire à l’aide de l’extracteur de micropipette et coupez l’extrémité de la pipette en verre capillaire tirée avec des ciseaux de microchirurgie pour générer une ouverture d’un diamètre extérieur d’environ 50 μm. Ensuite, stérilisez la pipette en verre sous une lumière UV sur un banc propre pendant environ 20 à 30 minutes.
   2. Montez la pipette en verre stérilisé sur le porte-pipette connecté à un système de distribution de micro-injection intracellulaire. Réglez les paramètres du système de micro-injection à 30 psi de pression et 8 ms de durée.
6. Système d’électroporation
   1. Connectez les électrodes au système d’électroporation à ondes carrées et réglez les paramètres suivants : 15 ms d’impulsions à 35 V avec des intervalles de 950 ms pour l’électroporation in vivo.
7. Solution de perfusion et de fixation
   1. Dissoudre la poudre de paraformaldéhyde (PFA) dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration de 4 % (p/v). Conservez la solution de PFA à 4 °C.

2. Procédures expérimentales

1. Exposition chirurgicale des DRG L4 et L5
   1. Anesthésie la souris à l’aide d’une injection intrapéritonéale de la solution anesthésique #1 préparée précédemment (avec de la kétamine 100 mg/kg de poids corporel et de la xylazine 12 mg/kg de poids corporel).
   2. Rasez la zone chirurgicale avec la tondeuse à fourrure.
      REMARQUE : Comme il y aura une autre intervention chirurgicale pour l’écrasement du nerf sciatique gauche, la fourrure de la cuisse postérieure gauche peut être rasée simultanément.
   3. Placez la souris sur la couverture chauffante (35,0 °C) et surveillez la température rectale à l’aide d’une sonde de température.
   4. Pour tester l’anesthésie, pincez les orteils et la queue de la souris et observez les réponses comportementales.
   5. Collez les quatre membres de la souris sur le tableau en liège.
   6. Essuyez la zone chirurgicale avec une solution d’iodophore, puis utilisez de l’alcool à 75 % pour enlever l’iodophore avant de couper la peau.
   7. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
   8. Avant l’incision, marquez les deux côtés des crêtes iliaques avec un marqueur fin. Tracer une ligne reliant les deux points des crêtes iliaques pour faciliter l’identification des positions des DRG L5.
   9. Faites une incision de 3 cm le long de la ligne médiane du bas du dos avec des microciseaux. De plus, détachez les muscles paraépineux, tels que le muscle multifide et le muscle longissimus lumborum, des apophyses épineuses L3 à S1, et exposez les articulations facettaires de L4-5 et L5-6.
   10. À l’aide d’un micro-rongeur, vous enlevez les facettes articulaires de L4-5 et L5-6. De plus, retirez l’arc neural gauche de L4 et L5 pour exposer la face dorsale des DRG.
2. DRG Injection
   1. Injectez une solution anesthésique #2 (avec avertin 200 mg/kg de poids corporel) par voie intrapéritonéale pour maintenir l’anesthésie avant l’injection de DRG.
   2. Chargez les plasmides d’ADN ou les oligonucléotides d’ARN (1 μL par DRG) dans la pipette capillaire en verre.
   3. Insérez soigneusement l’extrémité de la pipette en verre capillaire dans le DRG.
   4. Injectez progressivement une solution de 1,0 μL de plasmides d’ADN ou d’oligos d’ARN dans le DRG à l’aide des systèmes de distribution de micro-injection intracellulaire (30 psi, 8 ms).
      REMARQUE : La durée de l’injection ne doit pas durer moins de 5 minutes.
3. Electroporation
   1. Déposez du PBS sur les pointes des électrodes.
   2. Nettoyez le saignement avec de la gaze de coton carrée stérilisée.
   3. Pincez doucement le DRG cible avec les électrodes et appliquez 5 impulsions électriques carrées avec le système d’électroporation.
   4. Fermez respectivement les couches musculaires et cutanées avec des sutures en nylon 5-0.
   5. Placez la souris sur une couverture chauffante (35,0 °C) sous une attention particulière jusqu’à ce qu’elle ait repris suffisamment de conscience pour maintenir le décubitus sternal. Remettez la souris dans la cage domestique une fois qu’elle s’est complètement remise de l’anesthésie.
      REMARQUE : Il faut environ 60 minutes pour que la souris se remette complètement de l’anesthésie sur la couverture à 37 °C. Dissoudre un comprimé (200 mg) d’ibuprofène dans 1 000 ml d’eau (0,2 mg/ml) pour l’alimentation quotidienne afin de soulager la douleur post-chirurgicale.
4. Sciatic Nerve Crush
   1. Deux ou trois jours (selon le plan expérimental) après l’électroporation DRG, anesthésier la souris par voie intrapéritonéale avec la solution anesthésique #2 (avec avertin 400 mg/kg de poids corporel).
   2. Collez les quatre membres de la souris sur le tableau en liège.
   3. Faites une incision de 1 cm à 0,5 cm sur le côté gauche le long de la ligne médiane. Coupez les muscles, tels que le muscle grand fessier et le muscle piriforme, longitudinalement. Exposez le segment du nerf sciatique entre le grand foramen sciatique et l’encoche sciatique.
   4. Écrasez le nerf avec une pince de microchirurgie pendant 12 secondes et marquez le site d’écrasement avec une suture épineurale en nylon 10-0. Faites un nœud sur la membrane durale pour marquer le site d’écrasement.
   5. Fermez les couches musculaires et cutanées avec une suture en nylon 5-0.
   6. Placez la souris sur une couverture chauffante (35,0 °C) avec une attention particulière jusqu’à ce qu’elle ait complètement repris suffisamment conscience pour maintenir le décubitus sternal. Remettez la souris dans la cage domestique une fois qu’elle s’est complètement remise de l’anesthésie.
      REMARQUE : Il faut environ 60 minutes pour que la souris se remette complètement de l’anesthésie sur la couverture à 37 °C. Dissoudre un comprimé (200 mg) d’ibuprofène dans 1 000 ml d’eau (0,2 mg/ml) pour l’alimentation quotidienne afin de soulager la douleur post-chirurgicale.
5. Perfusion de souris, DRG et prélèvement du nerf sciatique
   1. Deux ou trois jours après l’écrasement du nerf sciatique (selon le plan expérimental), anesthésiez la souris par voie intrapéritonéale avec la solution anesthésique #2.
   2. Perfuser la souris par voie transcardiale avec du PBS (pH 7,4) suivi de paraformaldéhyde (PFA) glacé à 4 % (pH 7,5) dans du PBS.
   3. Après la perfusion, séparez soigneusement les DRG avec les racines nerveuses et le nerf sciatique avant le genou avec des micro-ciseaux et des micro-pinces sous le microscope de dissection. Placez le nerf sciatique directement dans 4 % de PFA pendant la nuit à 4 °C.
6. Imagerie et mesure des axones sensoriels marqués par fluorescence
   1. Retirez soigneusement le tissu et la membrane attachés sur le nerf sciatique fixe avec des micro-ciseaux et des micro-pinces sous le microscope de dissection. Ensuite, remplacez le PFA à 4 % par du PBS et lavez le nerf trois fois.
   2. Placez le nerf sciatique sur une lame et maintenez-le droit. Ajoutez 80 μL de solution anti-décoloration autour du nerf, puis posez une lamelle dessus dessus. Aplatissez tout le tissu monté avec une pression.
   3. Placez les tissus aplatis sur le microscope épifluorescent inversé équipé d’un accessoire pour l’acquisition en mosaïque et le traitement d’images.
      REMARQUE : Les longueurs d’excitation et d’émission sont de 488 nm et 509 nm. Il est également possible de prendre manuellement plusieurs images qui se chevauchent et d’assembler les images à l’aide d’ImageJ avec le plug-in Mosaic.
   4. Lorsque vous mesurez la longueur des axones régénérés, tracez tous les axones identifiables marqués par fluorescence dans le nerf sciatique depuis le site d’écrasement (marqué par la suture épineurale 10-0) jusqu’aux extrémités des axones distaux.