Transplantation stéréotaxique d’une suspension de cellules neurales chez une souris atteinte d’un traumatisme crânien

Résumé

Source : Furmanski, O., et al. Modèle d’impact cortical contrôlé de lésions cérébrales de souris avec transplantation thérapeutique de cellules neurales dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme. J. Vis. Exp. (2019)

Dans cette vidéo, des cellules neurales dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme sont injectées de manière stéréotaxique dans la bordure matière grise-substance blanche du cortex profond dans un modèle murin de lésion cérébrale traumatique. Les cellules transplantées s’intègrent dans le tissu, favorisant la récupération fonctionnelle et la réparation du circuit dans le cerveau blessé.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Transplantation stéréotaxique de suspension cellulaire

1. Commencer la procédure de transplantation cellulaire environ 24 heures après la craniectomie.
2. Préparez le matériel de transplantation cellulaire et les fournitures chirurgicales
   1. Remplissez une seringue à embout coulissant de 1 mL avec une solution saline stérile pour l’irrigation des plaies. Fixez une aiguille de 25 G à la seringue pour contrôler l’irrigation.
   2. Remplissez une seringue à embout coulissant de 1 mL avec une solution de CsA (cyclosporine A) pour l’immunosuppression. Fixez une aiguille de 25 G ou plus à la seringue CsA. Remplissez la seringue CsA au besoin entre les chirurgies.
   3. Préparez des aiguilles en verre à partir de pipettes capillaires en verre borosilicate de 1,0 mm de diamètre extérieur en utilisant des méthodes standard.
   4. À l’aide d’une pince à épiler fine, cassez les pointes des aiguilles jusqu’à ce qu’elles aient un diamètre d’environ 200 μm. Assurez-vous que la tige cylindrique de l’aiguille ne dépasse pas 2,5 cm.
3. Calibrez le pousse-seringue pour une utilisation avec une seringue de 10 μL. Entrez un débit de 0,2 μL/min pour fournir un volume total de 2,0 μL.
4. Préparez une suspension de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC).
   1. Effectuez toutes les manipulations cellulaires dans une hotte de culture cellulaire BSL-2 (niveau de biosécurité 2) en utilisant des techniques de manipulation stériles standard.
   2. Préparez les cultures cellulaires à l’avance selon les conditions standard définies pour le type de cellule.
      REMARQUE : Les expériences présentées dans cette démonstration ont utilisé diverses cellules de phénotype neural dérivées de hiPSC.
   3. Dissociez doucement les cellules en une suspension unicellulaire à l’aide d’une solution de détachement cellulaire ou d’un autre moyen enzymatique ou chimique préféré.
   4. Compter les cellules en suspension, puis diluer la suspension à 5 x 10⁴ cellules/μL dans un milieu de culture cellulaire minimal (p. ex., DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)) dans un tube à essai rabattable de 1,7 ml.
   5. Observez les remarques suivantes pour la transplantation :
      1. Maintenez les cellules en suspension à 37 °C pendant toute la durée des procédures.
      2. Ne chargez la seringue qu’immédiatement avant d’effectuer l’injection intraparenchymateuse
         REMARQUE : Si la suspension cellulaire est posée sur le côté, la gravité peut la faire se déposer ou s’accrocher sur le côté de la seringue, entraînant des irrégularités dans le nombre de cellules injectées.
      3. Allouer ~5 x 10⁵ cellules (suspension de 10 μL) par souris si plusieurs procédures de transplantation cellulaire sont effectuées en une journée.
5. Effectuer une chirurgie de transplantation stéréotaxique
   1. Placez la souris dans une chambre d’induction d’anesthésie connectée à un vaporisateur d’isoflurane avec une source d’oxygène comprimé. Induire une anesthésie avec ~3 % d’isoflurane à ~0,7 L/min d’oxygène.
   2. Placez la souris dans un cadre stéréotaxique avec un cône nasal anesthésique attaché.
      1. Fixez la tête en place avec des barres d’oreille et une barre de morsure, en orientant la tête de manière à ce que l’os frontal du crâne soit horizontal. Maintenez l’anesthésie à 1,5 % à 2 % d’isoflurane pendant toute la durée de la chirurgie.
   3. Effectuer les soins préopératoires et la préparation aseptique
      1. Appliquez une pommade ophtalmique hydratante contenant des antibiotiques sur les yeux à l’aide d’un coton-tige.
      2. Lavez le site d’incision avec une solution saline stérile pour nettoyer le site et desserrer les sutures. Appliquez doucement de l’éthanol à 70 % avec un coton-tige pour stériliser le site d’incision.
   4. Retirez les sutures à l’aide d’une pince à épiler fine et de ciseaux ophtalmiques. Irriguer le site de chirurgie et la craniectomie avec une solution saline stérile abondante.
      1. Si le cortex présente des caractéristiques disqualifiantes, telles qu’une hernie excessive, une décoloration, une vascularisation perturbée ou une hémorragie, l’animal doit être exclu.
   5. Chargez la seringue de greffe de cellules
      1. Déplacez la suspension cellulaire de l’incubateur à 37 °C vers une hotte de biosécurité pour la culture cellulaire. Agitez ou tapotez doucement le tube pour assurer une suspension cellulaire homogène.
      2. À l’aide d’une micropipette, chargez une suspension cellulaire de ~7,5 μL dans la seringue Hamilton par l’extrémité du piston.
         1. Tenez la seringue à un angle de ~120° avec l’extrémité du piston vers le bas. Insérez le piston en prenant soin de ne pas introduire de bulle d’air entre la suspension et l’embout du piston.
      3. Fixez l’ensemble de joint à l’aiguille de la pipette, puis fixez l’aiguille à la seringue.
      4. Poussez le piston pour déplacer la suspension de la cellule dans l’aiguille de la pipette. S’il y a une résistance à l’écoulement de la suspension, utilisez une pince à épiler fine pour casser la pointe de l’aiguille afin d’agrandir le diamètre.
   6. Fixez la seringue au pousse-seringue stéréotaxique. Avancez le piston pour vous assurer que l’ensemble de la pompe à seringue fonctionne correctement.
   7. Déplacez l’aiguille dans les coordonnées de l’injection.
      1. Alignez la pointe de l’aiguille sur bregma. Définissez les coordonnées X et Y sur 0. Déplacez ensuite la pointe de l’aiguille sur la craniectomie jusqu’à 2,0 mm latérale et -1,0 mm postérieure à la bregma. Touchez la pointe de l’aiguille sur la surface de la dure-mère et réglez la coordonnée stéréotaxique sur Z = 0.
      2. Poussez le piston pour vous assurer que la suspension cellulaire s’écoule correctement avant d’introduire l’aiguille dans le cerveau.
      3. Introduisez l’aiguille dans le cerveau à une profondeur de Z = -1,4 mm. Ces coordonnées stéréotaxiques placent le greffon à la frontière matière grise-matière blanche du cortex profond.
   8. Démarrez le pousse-seringue pour perfuser la suspension cellulaire. Réglez la minuterie de la paillasse de laboratoire sur 15 min et démarrez la minuterie. Utilisez un microscope à longue distance de travail pour surveiller l’écoulement des cellules en suspension.
      1. Irriguez le site de chirurgie avec une solution saline stérile pendant l’injection pour maintenir l’hydratation des tissus.
      2. À 15 min, retirez lentement l’aiguille de transplantation. Irriguez le site chirurgical avec une solution saline et fermez l’incision avec des sutures.
   9. Effectuer les soins postopératoires
      1. Arrêter l’anesthésie. Administrer le CsA par injection sous-cutanée dans la peau à une dose de 10 mg/kg. Placez la souris dans une cage postopératoire propre et préchauffée.
      2. Fournir un analgésique à base d’acétaminophène dans l’eau potable à raison de 1,0 mg/mL.
         REMARQUE : Fournir l’analgésique conformément au protocole d’exploitation normalisé (PON) approprié du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) et en tenant compte des variables de résultats expérimentaux.
      3. Fournissez une cage de récupération de nourriture humidifiée pour aider à la réhydratation et à la récupération.
6. Poursuivre les injections quotidiennes de CsA à 10 mg/kg pendant toute la durée de survie de la souris.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1 ml seringues	Becton Dickinson (BD)	309659
1.7 ml tubes à essai rabattables	Denville	C2170
10 microlitres seringue	Hamilton	7635-01
25G Aiguilles pour seringue Precision Glide	Becton Dickinson (BD)	305122
70 % d’éthanol			Produit de choix ; varie selon la région
Suspension orale d’acétaminophène	Tylenol (pour enfants)		Diluer à 1 mg/ml dans l’eau
Vaporisateur anesthésique	Vetland	0521-11-22
Chiffon		de manipulation des animaux	Achat dans le grand magasin
Betadine	Purdue Products	NDC-67618-151-32
Oxygène			Produit de choix ; varie selon la région
Cyclosporine A	Sigma-Aldrich	30024-100mg
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418-500ml
DMEM	Invitrogen (ThermoFisher)	A14430-01
Ruban isolant	3M Corporation		Achat dans un grand magasin
Pince à épiler Fine	Science Tools	11254-20
Forceps	Fine Science Tools	91106-12
Pipettes capillaires en verre, 1 mm OD, 0,58 mm ID	World Precision Instruments	1B100F-3
Kit de micromoteur rotatif à grande vitesse	Foredom Electric Co.	K.1070 - K.107018
Ideal Micro Drill Burr Set De 5	Cell Point Scientific	60-1000
Impact One Impacteur stéréotaxique pour CCI	Leica Biosystems	39463920
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-60
Minuteries de laboratoire	Fisher Scientific	14-649-17
Micropipette extracteur	MicroData Instruments, Inc.	PMP-102	N’importe quel extracteur suffira
Capots de protection de microscope	Fisherbrand	12-545-E
Support de montage			de lames de microscope Produit au choix
Miroir Achat			dans un grand magasin
Porte-aiguille hemostat	Fine Science Tools	12002-12
Ophtalmique pommade	Falcon Pharmaceuticals	NDC-61314-631-36
Ciseaux à ressort ophtalmiques	Outils de science fine	15018-10
Boîte			Achat dans un grand magasin
Cylindre en plastique Achat			dans un grand magasin
Pompe à seringue motorisée QSI Stoelting		53311
Raccord de compression à aiguille amovible	Hamilton	55750-01
Petit cadre stéréotaxique pour rongeurs	Stoelting	51925
Petits ciseaux	Outils scientifiques fins	14060-09
StemPro Accutase	Invitrogen (ThermoFisher)	A1110501
Coussinets de préparation à l’alcool stériles	Fisherbrand	06-669-62
Cotons-tiges stériles/Kendall Q-tips	Tyco Healthcare	540500
Saline stérile	Hospira	NDC-0409-1966-07
Chronomètres (2)	Fisher Scientific	06-662-56
Superfrost Plus Gold lames de microscope	Fisherbrand	15-188-48
Sutures - 5.0 soie avec aiguille incurvée	Oasis	MV-682

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