Transduction virale in utero chez une souris

Résumé

Source : Lutz, D., et al. Évaluation des paramètres de neuroplasticité ultrastructurale après transduction in utero du cerveau et de la moelle épinière de souris en développement. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo démontre la transduction virale par injection in utero dans des embryons de souris. Une souris enceinte est préparée pour la chirurgie et une incision médiane est pratiquée pour exposer les cornes utérines. Un mélange d’un virus contenant le gène souhaité et d’un colorant de suivi est injecté dans les embryons à l’intérieur des sacs utérins aux endroits ciblés. Les cornes utérines sont ensuite remises en place avant la suture.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. En transduction in utero

1. : Préparez un virus adéno-associé de type 1 (AAV1) codant pour la cible souhaitée (4 x 10¹¹ particules virales/μL d’AAV1) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à pH 7,4. Ajouter 0,1 mg/μL de Fast Green et maintenir le mélange AAV1-Fast-Green à 37 °C.
2. Préparez une pointe capillaire fine de la forme souhaitée (8 mm de longueur, avec un diamètre extérieur de 80 μm et un diamètre intérieur de 50 μm) à l’aide d’un extracteur de micropipette (réglages : pression = 500, chaleur = 700, traction = 0, vitesse = 80, temps = 200, voir le tableau des matériaux). Cassez l’extrémité du capillaire de manière à ce qu’elle soit de 4-5 mm.
3. Assemblez un tube d’aspirateur (44 cm x 0,7 cm) avec l’embout capillaire et aspirez 15 μL du mélange AAV1-Fast-Green dans le capillaire.
4. Maintenez les sujets animaux à une température corporelle physiologique constante de 37 °C pendant toute la procédure.
5. Placez une souris C57Bl/6 gravide (jour embryonnaire 14,5) dans la chambre de préincubation et anesthésiez la souris avec de l’isoflurane gazeux à 4 % (avec un débit d’air volumétrique de 0,6 à 0,8 L/min).
6. Par voie sous-cutanée, injecter de la buprénorphine (0,1 mg/kg de poids corporel).
7. Placez la souris anesthésiée sur la plaque chirurgicale préchauffée (37 °C).
8. Couvrez les yeux avec un lubrifiant.
9. Ajustez la souris avec le masque d’anesthésie (isoflurane gazeux à 1,5 % à un débit d’air volumétrique de 0,6 à 0,8 L/min) sur la plaque chirurgicale et rasez la région de la peau abdominale. Essuyez la région rasée avec de l’éthanol 3X 75 %, puis avec une solution de bétadine.
   REMARQUE : Surveillez en permanence le comportement respiratoire de la souris anesthésiée. Ajustez la concentration du gaz isoflurane en fonction du schéma d’inspiration-expiration de la souris.
10. Vérifiez l’absence de réflexe plantaire en serrant les phalanges de la patte arrière de la souris.
11. Ouvrez la cavité abdominale en saisissant la peau à l’aide d’une pince à iris dentelée incurvée (10 cm) et en coupant la peau le long de la linea mediana avec des ciseaux droits en carbure de tungstène (10 cm), puis en saisissant la paroi péritonéale avec une pince à épiler Dumont droite (12 cm, 0,2 mm x 0,12 mm) et en coupant la paroi le long de la linea alba avec des ciseaux de Vanna droits (8 cm).
12. Placez un morceau de film de paraffine fenêtré sur l’ouverture abdominale et fixez le film aux deux extrémités avec une pince hémostatique micro-moustique (12,5 cm, incurvée).
13. Exposez les cornes utérines à l’aide d’un dispositif semblable à une cuillère pour éviter d’endommager les embryons à l’intérieur des cornes utérines. Versez quelques gouttes de PBS (37 °C) sur les cornes utérines et inspectez les embryons à la recherche de dommages ou de malformations à l’intérieur du sac utérin.
14. Documentez l’ordre et la position des embryons dans les cornes utérines. Retournez soigneusement les embryons à l’intérieur du sac utérin jusqu’à ce que la position souhaitée pour l’injection soit atteinte.
15. Injectez 1 à 2 μL du mélange AAV1-Fast-Green en inspectant visuellement le site d’injection (p. ex., ventricules cérébraux) et la pénétration du colorant au microscope.
16. Documentez les embryons injectés et remettez les cornes utérines avec les embryons injectés dans la cavité abdominale.
17. Versez quelques gouttes de PBS (37 °C) dans la cavité abdominale. Fermez la cavité en suturant la paroi péritonéale (utilisez des sutures en polyamide 6-0) et la peau (utilisez des sutures en polyamide 3-0) à l’aide de la pince hémostatique moustique de Halsted (12,5 cm, incurvée). Alternativement, utilisez un simple motif interrompu ou des sutures/agrafes en acier inoxydable pour fermer la cavité abdominale et la peau.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
26Gx 1'' aiguille	Henke-Sass, Wolf GmbH
410 Unité d’anesthésie pour pompe à air	Instruments biomédicaux (Univentor)	8323102
Virus adéno-associé sérotype 1 (AAV1)	UKE (Viral Pour		les références et les zones cibles d’AAV1, voir : https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ et aussi : Vecteurs de livraison de gènes concepteurs : ingénierie moléculaire et évolution des vecteurs viraux adéno-associés pour un transfert de gènes amélioré. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 mars ; 25(3):489-99. Les vecteurs viraux AAV recombinants pseudotypés avec des capsides virales des sérotypes 1, 2 et 5 présentent une efficacité différentielle et un tropisme cellulaire après administration dans différentes régions du système nerveux central. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. août 2004 ; 10(2):302-17. Les vecteurs de virus adéno-associés recombinants auto-complémentaires (scAAV) favorisent une transduction efficace indépendamment de la synthèse de l’ADN. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 août ; 8(16) :1248-54.
Pompe à air	Instruments biomédicaux (Univentor)	Eheim 100
Aspirator tune	assemblies Sigma-Aldrich	A5177-5EA
Masque respiratoire souris Aluminium anodisé	Instruments biomédicaux (Univentor)	-
Buprénorphine	Temgesic		analgésiques
Capillaires	Science-Products	GB100TF-10	avec pince à épiler Dumont fillament
(#3, 12 cm, droite, 0,2 x 0,12 mm)	FST	11203-23
Rasoir électrique	Phillips	-
Sutures Ethicon (Ethilon, 6-0 et 3-0)	Lubrifiant		Ethicon-polyamide
	Bepanthene	-
Fast	Green Sigma-Aldrich	F7252	pour la visualisation de liquides injectés Commutateur d’acheminement de
gaz 4/2 connecteurs	Instruments biomédicaux (Univentor)	8433020
Pince hémostatique Halsted Mosquito (12,5 cm, droite)	FST	13011-12
Boîte à induction pour souris avec couvercle se déplaçant horizontalement.Dimensions intérieures : LxLxH : 155x115x130 mm.Épaisseur de paroi : 6 mm	Instruments biomédicaux (Univentor)	-
Pince à iris (10cm, incurvée, dentelée)	FST	14007-14
Ciseaux à iris (11cm, droite, carbure de tungstène)	FST	14501-14
Isofluran OP Tisch, chauffée électriquement, smDimensions extérieures : 257x110x18 mm.Surface de chauffage : 190x90 mmLe retrait de l’isoflurane s’échappant du masque respiratoire se fait vers le bas conformément à la réglementation	Biomedical Instruments (Univentor)	-
Isoflurane (Attane)	JD anesthésie médicale		par inhalation
Microscope optique Basic DM E	Leica-4x		(N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectifs
Micropipette pulle	Science-Products	P-97
Pince hémostatique Mosquito (12.5cm, incurvée)	FST	13010-12
Thermopuller P-97	Sutter Instruments
Tygon 6/4 Matériau de la tuyauterie pour l’assemblage de toutes les piècesDiamètre extérieur : 6mmDiamètre intérieur : 4mmEpaisseur de paroi : 1mm	Biomedical Instruments (Univentor)
Ciseaux Vannas (8 cm, droits)	FST	15009-08

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