Injection stéréotaxique d’hydrogel dans un modèle murin post-AVC

Résumé

Source : Wilson, K.L., et al. Injection d’échafaudages de biomatériau d’hydrogel dans le cerveau après un accident vasculaire cérébral. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo démontre l’injection stéréotaxique d’un hydrogel dans le noyau de l’AVC d’une souris post-AVC, soulignant son rôle dans la formation d’un échafaudage qui imite la matrice extracellulaire, favorise l’infiltration cellulaire et soutient l’angiogenèse, soulignant son potentiel neurothérapeutique dans le rétablissement de l’AVC.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

Injection d’hydrogel ou d’autres biomatériaux

1. Effectuez l’injection de biomatériaux à un moment défini par l’utilisateur. Dans cette expérience, les injections ont été effectuées entre 5 et 7 jours après l’AVC. 2 à 6 μL d’hydrogel sont injectés.
   1. Allume le coussin chauffant pour maintenir la température corporelle de la souris pendant l’anesthésie (37 °C).
   2. Préparez des ciseaux autoclavés, des pinces, du coton, de la pommade pour les yeux vétérinaires, de la colle chirurgicale ou du matériel de suture, de l’alcool stérile et des lingettes bêta-iodées. Préparez le foret à os avec des têtes de foret stériles et les seringues Hamilton en verre de 25 μL avec des aiguilles métalliques de 30 G.
   3. Activez la stérilisation par billes à 160 °C pour permettre la stérilisation des instruments entre les souris.
   4. Fixez les pompes d’injection au dispositif stéréotaxique. Réglez le débit sur 1 μL/min et réglez le volume sur 4 μL.
   5. Préparez une cage propre pour les souris après l’opération.
2. Placez la souris dans la chambre d’induction avec une concentration d’isoflurane de 4 % pour l’anesthésier jusqu’à ce que le mouvement spontané cesse et que sa respiration atteigne un rythme lent et régulier.
   1. Une fois endormi, transférez et fixez la souris sur le dispositif stéréotaxique avec une concentration d’isoflurane de maintien de 1,5 %.
   2. Appliquez la pommade oculaire vétérinaire sur les deux yeux.
   3. Rasez toute fourrure qui aurait pu repousser de la tête de la souris et préparez aseptiquement la zone en utilisant une lingette imbibée d’alcool suivie d’une lingette à l’iode bêta-iodé. Répétez trois fois.
      REMARQUE : Si nécessaire, utilisez une lingette imbibée d’alcool supplémentaire à la fin pour éliminer toute la bêta-iode, car elle provoque une irritation de la peau et conduit les souris à démanger leur crâne après la chirurgie.
3. À l’aide des petits ciseaux et/ou de la pince, rouvrez la peau au-dessus du cerveau. Utilisez du coton avec une solution saline stérile ou du PBS (solution saline tamponnée au phosphate) pour nettoyer tous les débris du crâne. Un cercle blanc-jaune (le trait, figure 1B) et le trou de bavure de la perceuse seront visibles. Si le tissu mort n’est pas visible, il est probable qu’aucun accident vasculaire cérébral ne s’est produit. Si le trou de la fraise n’est pas centré au-dessus de la course, percez à nouveau pour le centrer.
4. Orientez la pompe d’injection sur la souris et verrouillez-la à 90°. Nettoyez la seringue avec une solution saline stérile ou une solution PBS avant de recharger le matériel.
   1. Une fois propre, démontez la seringue en verre pour qu’il n’y ait pas d’aiguille. Chargez la seringue à l’aide d’une pipette à déplacement positif de 25 μL avec 10 μL d’hydrogel (ou d’un autre biomatériau ici avec ou sans cellules).
   2. À l’aide du piston de la seringue, poussez le gel jusqu’à l’avant de la seringue. Ensuite, remontez la seringue et continuez à pousser jusqu’à ce que le gel dépasse visiblement de l’aiguille.
5. Placez la seringue sur la pompe. Il peut être nécessaire d’ajuster l’arrière de la pompe pour que la seringue s’adapte. Réglez le débit à 30 μL/min, sélectionnez Retrait ou Injecter en fonction de la direction dans laquelle il doit se déplacer, puis appuyez sur Démarrer. Appuyez sur Stop lorsque l’arrière de la pompe est au bon endroit.
   1. Vissez l’arrière de la pompe pour que la seringue soit bien fixée. Si des ajustements ont déjà été effectués, assurez-vous que le débit est réglé à 1 μL/min et qu’il est réglé pour injecter.
6. Déplacez la pompe dans les directions x et y pour l’orienter sur le trou. Déplacez la pompe vers le bas dans la direction z jusqu’à ce que l’aiguille de la seringue touche le haut du trou.
7. Réinitialisez le Z sur la console d’affichage numérique. Ensuite, déplacez la seringue vers le bas dans la direction z de 0,750 mm. Si la seringue se plie ou s’il y a de la résistance, le crâne est cicatrisé ou n’a pas été complètement percé et doit être percé à nouveau.
8. Appuyez sur Start sur la console de la pompe pour injecter 4 à 6 μL d’hydrogel à un débit de 1 μL/min.
9. Réglez une minuterie de 5 minutes lorsque la pompe arrête d’injecter pour permettre au gel de commencer la réticulation.
10. Au bout de 5 minutes, tirez lentement la seringue vers le haut en tournant le z-nob. Surveillez pour voir si du matériau est accidentellement tiré ou s’il fuit du trou. Déverrouillez la pompe et éloignez-la de la souris lorsque l’aiguille est suffisamment éloignée du crâne.
11. À l’aide d’une pince, d’une colle chirurgicale ou de sutures, fermez la peau au-dessus de la tête. Placez la souris dans la cage propre et observez sa récupération. Cela devrait prendre environ 5 à 10 minutes pour que la souris se remette de l’anesthésie.

Résultats

Figure 1 : Représentation schématique du bregma et localisation du trait. (A) Les lobes pariétaux se rejoignent au sommet pour former le bregma. Le placement du laser a été centré à 2,0 mm à gauche du bregma. (

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
25uL Seringue Hamilton 702RN, sans aiguille	Fishcer Scientific	14824663	Seringues utilisées pour injecter des biomatériaux
25uL Pipette à déplacement positif	Gilson	M-25
Plate-forme de platine réglable	Kopf Instruments	901
C57BL/6 Souris	Jackson Laboratory	664	8-12 semaines
Cage Assembly Rob	Thorlabs	ER3-P4	3" Long, diamètre 6mm, pack de 4 - pour fixer le laser sur sterotax
Cotons-tiges	VWR	89031-288
CP 25 pointes de pipette	Gilson	F148012
Plaque chauffante	Kopf Instruments	HP-4M
IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center	VetEquip	901808
Jewlers Forceps #5	GFS chemicals	46085
Miltex Adson Pince à pansements, disséquante	Intefra Miltex	V96-118
Mini-pompe à débit variable	Thomas Scientific	70730-064	Pompe pour perfusions
Souris Gaz Anesthésie Support de tête	Kopf Instruments	923-B
Boîtier de contrôle Nanojet	Chemyx	10050
En-tête de pompe à nanojet	Chemxy	10051	Fixer à un dispositif stéréotaxique pour l’injection de biomatériau
Aiguille RN 30G PT STY 3, 0,5 pouce	Fishcer Scientific	NC9459562
Barres d’oreille non rompantes 60º	Kopf Instruments	922
Puralube Vet Ointment	Dr. Foster Smith	9N-76855
Sonde rectale Souris	Kopf Instruments	Ret-3-ISO
Sol-M U-100 Seringue insuline avec repères unitaires 0,5 mL	VWR	10002-726	Pour injecter rose bengale
StainTray Système de coloration de lame	Simport Scientific	M920-2	Pour la coloration des lames Dispositif
stérotaxique	Kopf Instruments	940	Instrument stéréotaxique pour petits animaux Pince
Adson pour étudiants - 1x2 dents	Outils pour les sciences fines	91127-12
Pinces pour les étudiants - tiges droites/larges	Outils pour les sciences fines	91113-10
Régulateur de température	Kopf Instruments	TCAT-2LV
Tissue-Tek composé OCT	VWR	25608-930
Vetbond Adhésif tissulaire 3mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-361931