Construction d’une interface nerveuse périphérique régénérative composite dans un modèle de lésion nerveuse chez le rat

Abstract

Source : Svientek, S. R., et al. Fabrication de l’interface nerveuse périphérique régénérative composite (C-RPNI) chez le rat adulte. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo démontre la construction chirurgicale d’une interface nerveuse périphérique régénérative composite (C-RPNI) dans un modèle de lésion nerveuse périphérique chez le rat. La procédure consiste à attacher un nerf péronier transecté à une greffe musculaire et à le recouvrir d’une greffe de peau dermique pour favoriser la régénération nerveuse. Au fil du temps, les neurones moteurs et sensoriels rétablissent des connexions au sein des greffons, permettant la formation de structures neuromusculaires et sensorielles fonctionnelles.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

REMARQUE : Les rats donneurs ont libre accès à la nourriture et à l’eau avant les procédures de don de peau et de muscle. L’euthanasie est réalisée sous anesthésie profonde suivie d’une injection intracardiaque de chlorure de potassium avec une méthode secondaire de pneumothorax bilatéral. N’importe quelle souche de rat peut théoriquement être utilisée dans cette expérience ; cependant, notre laboratoire a obtenu des résultats cohérents chez les rats Fischer F344 mâles et femelles (~200-250 g) à l’âge de deux à quatre mois. Les rats donneurs doivent être isogéniques aux rats expérimentaux.

1. Préparation de la greffe dermique

1. Anesthésier le rat donneur dans une chambre d’induction à l’aide d’une solution d’isoflurane à 5 % dans de l’oxygène à raison de 0,8-1 L/min. Une fois que le rat a été anesthésié, retirez-le de la chambre d’induction et placez-le sur un cône nasal de réinspiration, abaissant l’isoflurane à 2-2,5 % pour le maintien de l’anesthésie.
2. Administrer une solution de 0,02 à 0,03 mL de carprofène (50 mg/mL) dans 0,2 mL de solution saline stérile par voie sous-cutanée entre les omoplates pour l’analgésie.
3. Appliquez une pommade de larmes artificielles sur les deux yeux pour prévenir les ulcères cornéens.
4. À l’aide d’une tondeuse, rasez l’ensemble de la partie inférieure des membres postérieurs, de la cheville et des côtés des pattes.
5. Nettoyez le membre postérieur et la surface plantaire de la patte avec de l’alcool, puis une solution d’iodopovidone, en terminant par un nettoyage final à l’alcool pour éliminer les résidus d’iodopovidone.
6. À l’aide d’une perceuse à grande vitesse à micromoteur portatif avec une pierre de polissage ronde amovible à grain fin (4000 tr/min), meulez la surface plantaire de la patte pour enlever l’épiderme. Pendant le bavures, appliquez des gouttes de sérum physiologique afin de ne pas brûler la peau. Le derme sous-jacent aura un aspect brillant avec des saignements ponctuels.
7. Appliquez un garrot sur le membre inférieur pour ralentir la circulation sanguine.
8. Retirez brusquement la peau plantaire avec un scalpel #15 et placez-la dans une gaze humidifiée de solution saline pour éviter la dessiccation. Une partie du tissu tendineux et conjonctif sera intrinsèquement retirée avec la peau dans cette étape et sera retirée plus tard.
9. Appliquez une compresse de gaze sur le pied qui saigne pour ralentir l’hémorragie. Répétez les étapes 1.5 à 1.9 si vous effectuez deux constructions.
10. Au microscope (grossissement 20x), prélevez le tissu tendineux et conjonctif de la couche profonde de la greffe de peau à l’aide de microciseaux. Veillez à ne pas faire de trous dans la greffe. Le greffon dermique aminci doit être légèrement opaque et ne contenir que du derme, mesurant environ 0,5 cm x 1,0 cm.
11. Placer dans de la gaze humidifiée à l’aide d’une solution saline jusqu’à ce qu’il soit prêt pour la fabrication de la construction C-RPNI. Les greffons doivent être utilisés dans les 2 heures suivant la récolte.

2. Préparation de la greffe musculaire

1. : Faites une incision longitudinale le long de la face antérieure de la partie postérieure inférieure, juste au-dessus de la cheville jusqu’en dessous du genou, avec un scalpel #15. Disséquez à travers le tissu sous-cutané pour exposer la musculature sous-jacente.
2. Au niveau de la face distale de l’incision, exposez les insertions tendineuses de la musculature du membre inférieur. Le tibial antérieur (TA) est généralement le plus grand et le plus antérieur des muscles, et juste en dessous et en arrière de ce muscle se trouve le long extenseur des doigts (EDL). Isolez le tendon distal EDL des autres tendons de la zone, en prenant soin de ne pas inciser son insertion à ce stade.
3. Assurez l’isolation du bon tendon en insérant les deux dents d’une pince sous le tendon et en exerçant une pression vers le haut en ouvrant la pince pour provoquer une excursion du tendon. La manipulation de ce tendon devrait entraîner l’extension simultanée de tous les orteils.
4. Effectuez une ténotomie distale avec des ciseaux à iris pointus et séparez le muscle des tissus environnants avec des ténotomies (ou d’autres ciseaux à pointe émoussée), en travaillant proximal pour trouver l’origine tendineuse.
5. Une fois le tendon proximal visualisé, effectuez à nouveau une ténotomie à l’aide de ciseaux à iris tranchants. Placez le greffon musculaire dans une gaze humidifiée à l’aide d’une solution saline pour éviter la dessiccation.
6. Une fois que tous les greffons souhaités ont été prélevés sur un rat donneur, euthanasier principalement par injection intracardiaque de KCl (1-2 mEq K+/kg) suivie d’une euthanasie secondaire avec pneumothorax à ponction bilatérale avec une lame #15.

3. Isolement et préparation du nerf péronier commun

1. Anesthésier et analgésique chez le rat expérimental conformément au protocole décrit aux étapes 1.1 à 1.3.
2. Rasez la cuisse souhaitée et nettoyez avec de l’alcool, de la bétadine et terminez avec de l’alcool pour éliminer les traces de bétadine.
3. Déplacez l’animal de la table de préparation chirurgicale à la table du microscope chirurgical et placez-le sur un coussin chauffant avec une sonde de température pour le maintien de la température corporelle. Maintenir l’isoflurane à 2-2,5 % et l’oxygène à 0,8-1 L/min.
4. Marquez l’incision, s’étendant de la partie distale à l’encoche sciatique jusqu’à la partie inférieure du genou. Ce marquage doit être inférieur au fémur et incliné à l’opposé de celui-ci. Faites l’incision avec une lame #15, en incisant à travers le fascia sous-jacent du biceps fémoral.
5. Disséquez soigneusement le muscle du biceps fémoral à l’aide d’un appareil hémostatique ou de microciseaux à bout émoussé jusqu’à l’espace sous-jacent au biceps fémoral.
   REMARQUE : Le nerf sciatique se déplace approximativement dans la même direction que l’incision initiale qui a été pratiquée. Il y a trois branches, généralement avec le nerf sural postérieur et les nerfs péronier et tibial communs voyageant superficiellement et profondément vers le genou, respectivement.
6. Après l’identification du nerf péronier commun (CP), à l’aide d’une paire de micro-pinces à pointe fine et de micro-ciseaux, isolez soigneusement le nerf CP des autres branches sciatiques et retirez tout tissu conjonctif persistant distalement.
7. Au point où le nerf traverse la surface du genou, transectez brusquement le nerf avec une paire de microciseaux.
   REMARQUE : L’utilisation de ciseaux tranchants est extrêmement importante dans cette étape, car causer un traumatisme important au nerf pourrait augmenter le risque de formation d’un névrome.
8. Libérez soigneusement tout tissu conjonctif restant du nerf CP et travaillez proximal pour libérer le nerf à une longueur d’environ 2 cm.

4. Fabrication de la construction C-RPNI

1. Retirez le greffon musculaire de la gaze humidifiée de solution saline et retirez tout le tissu tendineux central ainsi qu’un petit segment central de l’épimysium. Laissez les extrémités tendineuses intactes.
2. L’utilisation d’un 8-0 suture en nylon, fixez l’épineurium de l’extrémité transectée du nerf CP à la zone de la greffe musculaire dépourvue d’épimysium avec deux points de suture interrompus de chaque côté du nerf.
3. Fixez le greffon musculaire au périoste du fémur à l’aide d’un seul point interrompu en nylon 6-0 à la fois proximale et distale, la jonction nerf-muscle étant tournée vers l’opposé du fémur.
   REMARQUE : Fixez le muscle de manière à ce qu’il soit à une longueur normale et détendue. Essayez de ne pas étirer le muscle de manière significative ou de ne pas laisser trop de laxité lors de la sécurisation.
4. Placez un 8-0 point de nylon au bord central inférieur de l’épimysium du greffon musculaire, le fixant à l’épineurium du nerf CP de manière à créer une laxité dans le nerf à l’intérieur du greffon musculaire et à aider à soulager toute tension future à laquelle il pourrait être exposé lors d’une marche ultérieure.
5. Retirez le greffon de peau de la gaze humidifiée de sérum salin et disposez-le sur le greffon musculaire de manière à couvrir complètement le nerf et la majorité du muscle. Assurez-vous que la marge profonde du derme repose sur le muscle. Coupez tout derme qui s’étend au-delà de la bordure du muscle.
6. Fixez le greffon de peau à la greffe musculaire sur la circonférence à l’aide de 8-0 Sutures interrompues en nylon. En règle générale, 4 à 8 sutures totales sont utilisées en fonction de la taille de la construction.
7. Fermez le fascia du biceps fémoral sur la construction de manière à courir avec une suture chromique 5-0.
8. Fermez la peau sus-jacente avec une suture chromique 4-0 à la manière d’un courant.
9. Frottez la zone chirurgicale avec un tampon imbibé d’alcool et appliquez une pommade antibiotique.
10. Cessez l’anesthésie par inhalation et laissez le rat se rétablir avec des sources de nourriture et d’eau séparées de celles de ses compagnons de cage.

Materials