Séparation des fractions membranaires internes et externes des bactéries à Gram négatif

Résumé

Source : Cian, M. B. et. al., Séparation de l’enveloppe cellulaire pour les bactéries à Gram négatif en fractions de membrane interne et externe avec ajustements techniques pour Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo montre la séparation des fractions membranaires interne et externe des bactéries à Gram négatif à l’aide de l’ultracentrifugation par gradient de saccharose. Les fractions membranaires sont purifiées et stockées à basse température pour une analyse ciblée des composants spécifiques à la membrane.

Protocole

1. Réactifs généraux et préparation des milieux pour l’extraction membranaire

1. Milieux de croissance bactérienne : Préparez et stérilisez 1 L de milieux de bouillon dans une fiole de 2 L soigneusement nettoyée et autoclavée.
2. Tampon de remise en suspension général (tampon 1 M de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (tampon Tris) pH 7,5 ; 50 mL) : Dissoudre 6,05 g de base Tris dans 30 mL de H₂O. Ajuster le pH à 7,5 avec 5 M HCl. Ajuster le volume final à 50 mL avec H2 O ultrapur.
3. Mère de solution de chélation cationique divalente (0,5 M d’acide éthylènediamine tétraacétique, EDTA pH 8 ; 100 mL) : Ajouter 18,6 g de tétraacétate d’éthylène disodique ·2H₂O à 80 mL de H₂O. Remuer vigoureusement et ajuster le pH à 8,0 avec de l’hydroxyde de sodium (NaOH). Ajustez le volume final à 100 mL avec du H₂O.
   REMARQUE : Le sel disodique de l’EDTA ne se dissoudra pas tant que le pH de la solution n’est pas ajusté à ~8,0 par l’ajout de NaOH.
4. Tampon osmotique A (0,5 M de saccharose, 10 mM de Tris pH 7,5 ; 1 L) : Peser 171,15 g de saccharose et le transférer dans une bouteille de 1 L. Ajouter 10 ml de 1 M de Tris pH 7,5. Ajuster à un volume final de 1 L avec H2 O. Conserver à4 °C.
5. Lysozyme (10 mg/mL ; 5 mL) : Peser 50 mg de lysozyme (blanc d’œuf de poule) et dissoudre dans 5 mL de H₂O. Conserver à 4 °C.
6. Solution divalente divalente de chélation cationique diluée (1,5 mM EDTA ; 500 mL) : Ajouter 1,5 mL d’EDTA 0,5 M (étape 1.3) à 497,5 mL de H₂O. Conserver à 4 °C.
7. Tampon osmotique B (0,2 M de saccharose, 10 mM de Tris pH 7,5 ; 2 L) : Peser 136,8 g de saccharose et le transférer dans une bouteille de 2 L. Ajouter 20 ml de 1 M de Tris pH 7,5. Ajuster le volume final à 2 L avec un H₂O. Conserver à 4 °C.
8. Cofacteur des nucléases (chlorure de magnésium 1 M, MgCl₂ ; 10 mL) : Dissoudre 2,03 g de MgCl₂·6H₂O dans 8 mL de H₂O ultrapur. Ajuster le volume à 10 mL. Conserver à température ambiante.
9. Cocktail de solutions de nucléases comprenant des enzymes RNase et DNase : Voir le tableau des matériaux. Conserver à -20 °C.
10. Cocktail d’inhibiteurs de protéase : Voir tableau des matériaux. Conserver à 4 °C.
11. Solution isopycnique à gradient de saccharose à faible densité (20 % p/v de saccharose, 1 mM d’EDTA, 1 mM de solution de Tris pH 7,5 ; 100 mL) : Peser 20 g de saccharose et transférer dans une bouteille de 200 mL. Ajouter 100 μL de tampon Tris 1 M pH 7,5 et 200 μL de 0,5 M EDTA pH 8. Ajustez le volume final à 100 mL avec du H₂O. Conserver à température ambiante.
12. Solution de gradient de saccharose isopycnique de densité moyenne (53 % p/v de saccharose, 1 mM d’EDTA, 1 mM de solution de Tris pH 7,5 ; 100 mL) : Peser 53 g de saccharose et transférer dans un cylindre gradué de 200 mL. Ajouter 100 μL de tampon Tris 1 M pH 7,5 et 200 μL de 0,5 M EDTA pH 8. Ajustez le volume final à 100 mL avec du H₂O. Conserver à température ambiante.
    REMARQUE : Préparez cette solution dans un cylindre gradué pour assurer la précision en raison du pourcentage élevé de saccharose. Ajoutez une barre d’agitation magnétique et remuez jusqu’à ce que le saccharose soit complètement dissous dans la solution. Ce processus peut prendre plusieurs heures.
13. Solution isopycnique à gradient de saccharose à haute densité (73 % p/v de saccharose, 1 mM d’EDTA, 1 mM de solution de Tris pH 7,5 ; 100 mL) : Peser 73 g de saccharose et transférer dans un cylindre gradué de 200 mL. Ajouter 100 μL de tampon Tris 1 M pH 7,5 et 200 μL de 0,5 M EDTA pH 8. Ajustez le volume final à 100 mL avec du H₂O ultrapur. Conserver à température ambiante.
    REMARQUE : Préparez cette solution dans un cylindre gradué pour assurer la précision en raison du pourcentage élevé de saccharose. Ajoutez une barre d’agitation magnétique et remuez jusqu’à ce que le saccharose soit complètement dissous. Ce processus peut prendre plusieurs heures.
14. Tampon de stockage à membrane isolée (10 mM Tris Buffer pH 7,5 ; 1 L) : Ajouter 1 mL de 1 M Tris Buffer pH 7,5 dans une fiole de 1 L et ajuster le volume final à 1 L avec du H₂O ultrapur.

2. Préparation des bactéries pour l’extraction membranaire

1. Étalez les bactéries des stocks de glycérol congelés sur des plaques de gélose fraîches. Conservez les plaques à 4 °C une fois que les colonies se développent. Inoculer une seule colonie dans un tube de 5 mL rempli de milieu de bouillon et cultiver les bactéries comme vous le souhaitez pendant la nuit.
2. Diluez à contre-courant la culture bactérienne pendant la nuit dans 1 L de milieu de bouillon préféré et cultivez les bactéries jusqu’à ce que la densité optique souhaitée soit atteinte.
   REMARQUE : Il est recommandé d’inoculer une seule colonie bactérienne dans 1 L de milieu de bouillon pour les génotypes mutants qui ont tendance à supprimer les phénotypes de croissance, mais certaines bactéries à Gram négatif se développent simplement plus lentement que d’autres. S’il n’est pas possible d’obtenir une densité de culture suffisante par inoculation en une seule colonie, la dilution d’une culture pendant la nuit dans 1 L de milieu est une stratégie pour synchroniser la croissance. La composition de la membrane bactérienne varie en fonction de la phase de croissance de la culture (phase logarithmique ou stationnaire). Des courbes de croissance mesurant la variation de la densité optique des cultures bactériennes en fonction du temps doivent être effectuées avec toutes les souches afin de corréler la densité de la culture avec la phase de croissance.
3. Placez les flacons contenant les cultures de bouillon sur de la glace. Lire la densité optique à 600 nm (OD₆₀₀) et calculer le volume de culture équivalent à 6,0 et 8,0 x 10¹¹ unités de formation de colonies bactériennes (UFC). Pour S. Typhimurium, cela correspond à 1 L de culture à une DO₆₀₀ comprise entre 0,6 et 0,8, car une DO 600 de 1,0 équivaut à environ 1,0x10⁹ UFC/mL. Ajoutez ce volume dans un tube à centrifuger et assurez-vous que les cultures restantes restent sur de la glace jusqu’à ce qu’elles soient utilisées.
4. Granulez les bactéries par centrifugation à 4 °C à 7 000-10 000 x g dans une centrifugeuse à grande vitesse à angle fixe pendant 10 min
   REMARQUE : Pré-refroidissez et maintenez les centrifugeuses à basse température. Maintenez les échantillons sur de la glace pendant toute la procédure.
5. Décanter et jeter soigneusement le surnageant.
   REMARQUE : Si les fractions membranaires ne doivent pas être extraites immédiatement, la pastille peut être surgelée et/ou stockée à -80 °C. Cependant, il est recommandé de procéder directement à la plasmolyse le jour même de la récolte des cellules, en particulier pour les espèces non entérobactériennes.

3. Dissociation de la membrane externe et plasmolyse

1. Décongeler les pastilles cellulaires sur de la glace si elles ont été préalablement stockées à -80 °C, et conserver les échantillons sur de la glace pour le reste de la procédure. Remettez en suspension chaque pastille de cellule dans le tube à centrifuger dans 12,5 mL de tampon A. Ajoutez une barre d’agitation magnétique à la suspension des cellules.
2. Ajouter 180 μL de lysozyme à 10 mg/mL (concentration finale de 144 μg/mL) à chaque remise en suspension cellulaire. Conservez les échantillons sur de la glace pendant 2 min en remuant.
3. Ajouter 12,5 mL de solution d’EDTA de 1,5 mM à chaque remise en suspension de cellule et continuer à agiter sur de la glace pendant 7 minutes supplémentaires.
4. Décanter la suspension dans un tube conique de 50 mL et centrifuger à 9 000-11 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
5. Jetez les surnageants dans un conteneur de déchets biologiques dangereux et conservez les granulés sur de la glace.
6. Ajouter 25 ml de tampon B à la pastille de cellule.
7. Ajouter 55 μL de 1 M MgCl₂, 1 μL de réactif de nucléase RNase/DNase (pour éviter les problèmes de viscosité associés aux bactéries subissant une plasmolyse avant l’homogénéisation) et 1 μL de cocktail inhibiteur de protéase au volume de tampon B qui se trouve au-dessus de la pastille cellulaire
8. Remettre la pastille en suspension dans le mélange de tampon B. Pipeter vigoureusement et agiter au vortex jusqu’à ce que l’on observe une solution homogène.
   REMARQUE : Il est très important d’avoir une solution homogène avant de passer à l’étape 4 de ce protocole. Les cellules remises en suspension doivent avoir une apparence et une consistance visqueuses, semblables à celles d’une pâte à gâteau.
9. Agiter chaque échantillon pendant 15 s. Conserver les suspensions sur la glace et passer à l’étape 4.

4. Homogénéisation et lyse sous pression
REMARQUE : Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour la lyse. La sonication n’est pas idéale en raison de la génération de chaleur. La lyse osmotique peut être réalisée, mais elle est souvent inefficace. Par conséquent, nous recommandons la lyse à haute pression. La lyse à haute pression peut être réalisée à l’aide d’une variété d’instruments. Nous vous suggérons des machines d’homogénéisation, telles que la presse française ou l’Emusliflex. Nous travaillons avec de nombreux types de bactéries à Gram négatif dont la réponse aux solutions de saccharose à haute teneur osmolaire varie. L’étape d’homogénéisation à haute pression améliore l’efficacité, la reproductibilité et le rendement.

1. Prérefroidissez la cellule de la presse française à 4 °C ou insérez la bobine métallique de l’homogénéisateur sur de la glace.
2. Versez l’échantillon dans la cellule à pression française ou dans le cylindre d’homogénéisateur d’échantillon et amenez la cellule sous la pression d’homogénéisation souhaitée (10 000 psi doivent être suffisants lors de l’utilisation d’une presse française ou 20 000 psi lors de l’utilisation d’un homogénéisateur).
3. Ajustez le débit de sortie à environ une goutte par seconde tout en maintenant la pression si vous utilisez une presse française.
4. Prélever le lysat cellulaire dans des tubes coniques de 50 mL tout en gardant les échantillons sur de la glace.
5. Répétez les étapes 4.2 à 4.4 trois à cinq fois pour obtenir une lyse complète, ce qui est généralement indiqué par une augmentation progressive de la transparence de l’échantillon.
   REMARQUE : La chambre d’échantillonnage doit être lavée et équilibrée avec le tampon B entre les échantillons.
6. Gardez les cellules lysées sur de la glace.

5. Centrifuge de fractionnement membranaire total

1. les échantillons bactériens lysés à 6 169 x g pendant 10 min à 4 °C pour granuler le reste du matériau cellulaire intact. (p. ex., cellules bactériennes non lysées).
2. Répartissez la portion restante du surnageant, qui contient maintenant les membranes homogénéisées, dans une bouteille en polycarbonate pour l’ultracentrifugation.
   ATTENTION : Si nécessaire, les échantillons de cellules peuvent être équilibrés en les diluant avec le tampon B.
3. Ultracentrifuger la cellule lysat à 184 500 x g pendant au moins 1 h, à 4 °C. Cette étape peut être réalisée pendant la nuit sans affecter la qualité des membranes.
4. Jeter le surnageant restant présent dans le tube d’ultracentrifugation et conserver les pastilles de membrane sur de la glace (figure 1).
5. Remettre en suspension les pastilles de membrane dans 1 mL de la solution à gradient isopycnique-saccharose de faible densité à l’aide d’un homogénéisateur en verre. Transvaser l’homogénat de l’échantillon dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL à l’aide d’une pipette Pasteur en verre et le conserver sur de la glace.
   REMARQUE : Si seule une analyse de la composition totale de la membrane est souhaitée, substituer 1 mL de solution de gradient isopycnique-saccharose de faible densité à 1 mL de tampon de stockage à membrane isolé. L’étape 5.5 est le point final de l’isolement si l’on ne souhaite que des échantillons totaux de membrane bactérienne. Conserver les échantillons à -20 °C jusqu’à ce qu’une analyse plus poussée en aval soit nécessaire.

6. Ultracentrifugation à gradient de densité pour séparer les membranes doubles

1. Rassemblez le nombre approprié de tubes en polypropylène ou en polypropylène ultra-transparent de 13 ml spécifiés pour un rotor à godets oscillants et une ultracentrifugeuse.
2. Tenez le tube dans une position légèrement inclinée et préparez le gradient de saccharose en ajoutant lentement des solutions de saccharose de densité supérieure à plus faible dans l’ordre suivant :2 mL de saccharose à 73 % p/v, 1 mM d’EDTA, 1 mM de Tris pH 7,54 mL de saccharose à 53 % p/v, 1 mM d’EDTA, 1 mM de Tris pH 7,5
   1. Ensuite, ajouter la fraction totale de la membrane (1 mL), qui a été remise en suspension dans la solution de saccharose à 20 % p/v (étape 5.5). Évitez de mélanger la fraction membranaire avec la solution de saccharose qui se trouve en dessous. Les divisions doivent être visibles entre chacune de ces couches.
   2. Enfin, remplissez le tube avec la solution de gradient isopycnique-saccharose à faible densité (environ 6 ml). Les tubes ouverts en polypropylène et ultra-transparents doivent être remplis aussi complètement que possible (à 2 ou 3 mm du haut du tube) pour le support du tube.
3. Ajustement pour Acinetobacter baumannii 17978
   1. Adaptez un gradient de saccharose ajusté pour une utilisation avec différents échantillons bactériens. Dans le cas d’A. baumannii, le gradient de saccharose suivant a permis une séparation plus complète des membranes (figure 2).2 mL de saccharose à 73 % p/v, 1 mM d’EDTA, 1 mM de Tris pH 7,54 mL de saccharose à 45 % p/v, 1 mM d’EDTA, 1 mM de Tris pH 7,5
   2. Ensuite, ajoutez la fraction totale de la membrane (1 mL), qui a été remise en suspension dans la solution de saccharose à 20 % p/v (étape 5.5). Évitez de mélanger la fraction membranaire avec la solution de saccharose qui se trouve en dessous. Les divisions doivent être visibles entre chacune de ces couches.
   3. Enfin, remplissez le tube avec une solution de gradient isopycnique-saccharose à faible densité (environ 6 ml). Les tubes ouverts en polypropylène et ultra-transparents doivent être remplis aussi complètement que possible (à 2 ou 3 mm du haut du tube) pour le support du tube.
4. Ultracentrifuger les échantillons à l’aide d’un rotor à godet oscillant à 288 000 x g et 4 °C pendant la nuit.
   REMARQUE : Pour les volumes utilisés dans les étapes précédentes, nous recommandons des temps de centrifugation compris entre 16 h et 23 h.
5. Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette P1000 à environ 5 mm de la pointe. À l’aide de la pipette, retirez la couche supérieure brune de la membrane intérieure (IM). Transférez la fraction IM dans une bouteille en polycarbonate pour l’ultracentrifugation.
6. Laissez environ 2 mL de la solution de saccharose au-dessus de l’interface 53-73 % pour vous assurer que la membrane externe blanche inférieure n’est pas contaminée par la fraction IM. Répétez la procédure de pipetage à partir de l’étape 6.4 pour la fraction MO (Figure 1).
   REMARQUE : Les membranes peuvent également être collectées en perforant les tubes de centrifugation au fond avec une aiguille et en les recueillant sous forme de fractions goutte à goutte.
7. Remplissez le vide restant du tube d’ultracentrifugation avec un tampon de stockage à membrane isolée et mélangez par inversion ou pipetage. Conservez les échantillons sur de la glace.
8. Recueillir les membranes maintenant lavées et isolées par ultracentrifugation à 184 500 x g pendant 1 h à 4 °C.
9. Jeter le surnageant et remettre en suspension les membranes par homogénéisation Dounce. Ajouter 500 à 1000 μL de tampon de stockage. Prélever des échantillons dans des tubes de microcentrifugation de 2 ml.
10. Conservez les échantillons de membrane bactérienne à -20 °C.

Résultats

Figure 1 : Un schéma illustrant la procédure d’isolement de la membrane bactérienne à Gram négatif décrite dans cet article sur les méthodes. La procédure utilisée pour collecter les cellules bactériennes et isoler les membranes totale, interne ...

Matériaux