Dosage de la réplication de Legionella pneumophila dans les macrophages prétraités avec des vésicules membranaires externes

Résumé

Source : Jung, A. L. et. al., Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles : Isolement et analyse de leur potentiel pro-inflammatoire sur les macrophages. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo montre le prétraitement de macrophages avec des vésicules de membrane externe (OMV) de Legionella pneumophila pour examiner leur effet sur la réplication bactérienne. En modifiant la signalisation immunitaire de l’hôte, les OMV rendent les macrophages plus permissifs à l’infection. Un nombre plus élevé de colonies dans les cellules traitées, par rapport aux cellules non traitées, indique que les OMV favorisent la réplication de L. pneumophila à l’intérieur des macrophages.

Protocole

1. Prétraiter les macrophages

1. Préparez les cellules THP-1 (Tohoku Hospital Pediatrics-1 cells, une lignée cellulaire de leucémie monocytaire humaine).
   REMARQUE : THP-1 est une lignée cellulaire monocytaire dérivée d’un patient atteint de leucémie.
   1. Ajoutez 2x10⁵ cellules THP-1 par 24 puits et différenciez-les en ajoutant 20 nM de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) dans des cellules de type macrophage. Incuber pendant 24 h à 37 °C.
   2. Remplacer le milieu par 500 μL de milieu frais et incuber pendant 24 heures supplémentaires ; le milieu optimal pour les cellules THP-1 comprend le milieu à haute teneur en glucose du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 complété par 10 % de sérum de veau fœtal.
2. Isolez les macrophages murins dérivés de la moelle osseuse (BMDM).
3. Traiter les macrophages dérivés du THP-1 ou la BMDM avec des vésicules de membrane externe (OMV).
   1. Décongelez les OMV et ajoutez-les aux macrophages humains ou murins en fonction de leur quantité de protéines (0,1, 1 et 10 μg/mL). Incuber les macrophages avec des OMV à 37 °C pendant au moins 20 h.

2. Infectez les macrophages et évaluez la réplication bactérienne à l’aide d’un test d’unité formant des colonies (UFC)

1. Utilisez Legionella pneumophila, des cellules THP-1 prétraitées ou une BMDM prétraitée de l’étape 4.3, et non des macrophages prétraités comme témoins (2 x 10⁵/24 puits). Ne pas échanger le support.
2. Infecter les cellules THP-1 avec L. pneumophila Corby WT et mBMDM avec un mutant dépourvu de flagelle de L. pneumophila Corby (tous deux avec une multiplicité d’infection (MOI) de 0,5 ; 1x10⁵ L. pneumophila/24 puits) et incuber pendant 24 et 48 h, respectivement.
3. Lyser les cellules dans leur milieu par l’ajout de saponine (concentration finale : 0,1 %) et incuber à 37 °C pendant 5 min.
4. Remettez les bactéries en suspension par pipetage et transférez la suspension dans un récipient de réaction. Préparez des dilutions en série du milieu contenant L. pneumophila dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).
5. Striez 50 μL des dilutions requises sur des plaques gélosées d’extrait de levure de charbon de bois tamponné (BCYE) et incubez pendant 3 jours à 37 °C.
6. Comptez visuellement les colonies formées. Calculez le CFU

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Normalisez le résultat du comptage des CFU pour qu’il ne soit pas prétraité, mais qu’il infecte les macrophages, qui sont réglés à 100 %.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10 cm pétridish	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Allemagne)	82.1473
Charbon actif	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Allemagne)	X865.2
Agar-agar, Kobe I	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Allemagne)	5210.2
Gélose Columbia avec 5 % de sang de mouton	Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Allemagne)	254005
Nitrate ferrique non hydraté	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Allemagne)	5632.1
Sérum de veau fœtal (FCS)	Life Technologies GmbH (Darmstadt, Allemagne)	10270-106
Incubateur à dioxyde de carbone Heracell 240i	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Allemagne)	40830469
Heraeus Multifuge X3R	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Allemagne)	75004515
Boucle d’inoculation	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Allemagne)	86.1567.010
L. pneumophila Corby	---	---	Aimablement fourni par Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Allemagne)
L. pneumophila Corby ΔflaA	---	---	Aimablement fourni par Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlin, Allemagne)
mBMDM	---	---	Aimablement fourni par Prof Dr Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Allemagne) et Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Allemagne)
PBS	Biochrom GmbH (Berlin, Allemagne)	L 1825
Phorbol 12-myristate 13-acétate	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Allemagne)	P8139-1MG
Agitateur rotatif (MaxQ 6000)	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Allemagne)	SHKE6000
RPMI 1640 high glucose	Life Technologies GmbH (Darmstadt, Allemagne)	11875-093
Saponin	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Allemagne)	9622.1
Ultrospec 10	Biochrom Ltd (Cambridge, Angleterre)	80-2116-30
THP-1	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Allemagne)	88081201-1VL
Sorvall Discovery 100 SE	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Allemagne)
Extrait de levure	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Allemagne)	2363.2