Procédure de récolte bactérienne et de lyse mécanique

Résumé

Source : Mercier, N., et al. Purification de l’affinité MS2 couplée au séquençage de l’ARN chez les bactéries à Gram positif. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo montre une procédure étape par étape pour récolter des cellules bactériennes et les lyser mécaniquement pour libérer du contenu intracellulaire.

Protocole

1. Récolte des bactéries

ATTENTION : Cette étape implique la manipulation de bactéries pathogènes.

1. Cultiver une colonie de souches portant les plasmides pCN51-P3-MS2-sRNA ou pCN51-P3-MS2 dans 3 mL de milieu de perfusion cerveau-cœur (BHI) complété par de l’érythromycine (10 μg/μL) en doubles.
2. Diluer chaque culture de nuit dans 50 mL (≈1/100) de milieu BHI frais complété par de l’érythromycine (10 μg/μL) pour atteindre une DO_{de 600 nm} de 0,05. Utiliser des flacons stérilisés de 250 mL (rapport flacon/milieu de 5:1).
   REMARQUE : Le milieu et les conditions de croissance doivent être réglés en fonction du profil d’expression de l’ARNs étudié.
3. Cultivez les cultures à 37°C en secouant à 180 tr/min pendant 6 h.
4. Transvaser chaque culture dans un tube à centrifuger de 50 ml.
5. Centrifuger à 2 900 x g pendant 15 min à 4°C. Jeter le surnageant.
6. Conservez les granulés sur de la glace et effectuez directement la lyse cellulaire mécanique ou congelez et stockez les granulés à -80 °C.

2. Lyse mécanique des cellules

ATTENTION : Les étapes suivantes doivent être effectuées sur de la glace et les tampons doivent être à 4 °C. Utilisez des gants et prenez toutes les précautions pour protéger les échantillons des RNases.

1. Remettre les granulés en suspension (étape 1.6) dans 5 mL de tampon A (150 mM de KCl, 20 mM de Tris-HCl pH 8, 1 mM de MgCl₂ et 1 mM de DTT).
2. Transférez les cellules remises en suspension dans des tubes à centrifuger de 15 mL avec 3,5 g de billes de silice (0,1 mm).
3. Insérez des tubes dans un instrument de lyse cellulaire mécanique. Exécutez un cycle de 40 s à 4,0 m/s.
   REMARQUE : Si un cycle ne suffit pas à casser les cellules, laissez l’appareil refroidir pendant 5 min tout en gardant les échantillons sur de la glace. Ensuite, répétez un autre cycle de 40 s à 4,0 m/s. L’efficacité de la lyse cellulaire peut être testée en plaquant le surnageant sur une plaque de gélose BHI.
4. Centrifuger à 15 700 x g pendant 15 min. Récupérer le surnageant et le maintenir sur de la glace.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
15 mL tubes à centrifuger	Falcon	352070
50 mL tubes à centrifuger	Falcon	352051
250 mL	Dominique Dutscher	2515074	Cultures
BHI (Brain Heart Infusion) Bouillon	Sigma-Aldrich	53286	Milieu de croissance
Érythromycine (éry)	Sigma-Aldrich	Fluka 45673	Milieu
de croissance Matrice de lysing B En vrac	MP Biomedicals	6540-428	Lyse mécanique
RNAPro Solution	MP Biomedicals	6055050	Lyse mécanique
Dispositif FastPrep	MP Biomedicals	116004500	Spectrophotomètre à lyse mécanique
Genesys 20	ThermoFisher Scientific	11972278	Cultures bactériennes

flacon de culture bactériennes