Isolement d’ARN bactérien cible lié à un petit ARN régulateur à l’aide de la purification par affinité

Résumé

Source : Mercier, N., et. al., MS2-Affinity Purification couplée au séquençage de l’ARN chez les bactéries à Gram positif. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo démontre l’isolement de petits ARN régulateurs (ARNs) marqués par MS2 et liés à leur ARN cible bactérien à l’aide d’une purification par affinité avec une fusion de protéines de liaison au maltose (MBP) et de protéines d’enrobage MS2 immobilisées sur de la résine d’amylose.

Protocole

Tampons et milieux

Pour les expériences MAPS, préparez les tampons et les milieux suivants :- Tampon A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl₂ et 1 mM DTT)- Tampon E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltose, 0,1 % Triton, 1 mM MgCl₂ et 1 mM DTT)

Préparation de la colonne

ATTENTION : Veillez à ne pas laisser sécher la résine amylose. Si nécessaire, scellez la colonne avec un embout. Préparez toutes les solutions avant de commencer la purification par affinité.

1. Placez une colonne de chromatographie dans un rack de colonne.
2. Retirez l’embout de la colonne et lavez-la avec de l’eau ultra-pure.
3. Ajouter 300 μL de résine amylose.
4. Lavez la colonne avec 10 ml de tampon A.
5. Diluez 1 200 pmol de protéine MBP (Maltose-binding protein)-MS2 dans 6 mL de tampon A et chargez-le dans la colonne.
6. Lavez la colonne avec 10 ml de tampon A.

Purification par affinité MS2 (Figure 1)

1. Chargez le lysat cellulaire dans la colonne.
   REMARQUE : Conservez 1 mL de lysat cellulaire (extrait brut, CE) pour extraire l’ARN total et effectuez une analyse par transfert de Northern et une analyse transcriptomique.
2. Recueillir la fraction d’écoulement (FT) dans un tube de collecte propre.
3. Lavez la colonne 3 fois avec 10 ml de tampon A. Récupérez la fraction de lavage (W).
4. Éluer la colonne avec 1 mL de tampon E et recueillir la fraction d’élution (E) dans un microtube de 2 mL.
5. Conservez toutes les fractions collectées sur de la glace jusqu’à l’extraction de l’ARN ou congelez-les à -20 °C pour une utilisation ultérieure.

Résultats

Figure 1. Illustration schématique du protocole MAPS adapté à Staphylococcus aureus. De la construction des plasmides à l’analyse des données.

Matériaux