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1. Préparation de souches bactériennes ou de banques de mutants
1. Épluchez les souches à tester sur des plaques de gélose appropriées. Il s’agit de plaques de crosse pour l’expérience.
1. Incuber les plaques pendant la nuit à la température souhaitée pour obtenir des colonies individuelles. Pour cette expérience, cultiver K. pneumoniae (souches NTUH-K2044 et ATCC43816) sur une gélose au bouillon Luria (LB) à 37 °C, et S. pneumoniae (23F de type sauvage et 23F Δcps) sur de la gélose au sang dans un bocal à bougie humidifié à 37 °C.
2. Prélever une seule colonie dans une assiette de stock (étape 1.1) pour inoculer 10 mL de bouillon approprié à l’aide d’une boucle stérile ou d’un bâtonnet à cocktail. Pour le criblage de banques de mutants aléatoires, inoculez le bouillon avec 10 μL de la banque de mutants aléatoires (TraDIS Library).
1. Incuber les souches de K. pneumoniae dans un milieu LB à faible teneur en sel à 37 °C en agitant, et les souches de S. pneumoniae dans un milieu de perfusion cerveau-cœur (BHI), statiquement à 37 °C.
2. Transférez la culture de nuit dans un tube de 15 mL et centrifugez-la dans une centrifugeuse de paillasse pendant 10 min à 3 200 x g dans des seaux pivotants avec des inserts de tube de 15 mL et des couvercles étanches aux aérosols.
3. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 2 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
REMARQUE : Éliminer le surnageant par la voie appropriée de traitement des déchets biologiques liquides en laboratoire. Le but des étapes de centrifugation et de remise en suspension (1.2.2 et 1.2.3) est de concentrer les bactéries pour une visualisation facile sur le gradient. Les cultures bactériennes peuvent être chargées directement sur le gradient si vous le souhaitez. Les souches fortement capsulées peuvent ne pas former une pastille serrée. Si cela se produit, retirez autant de surnageant que possible sans enlever de cellules bactériennes, ajoutez 1 fois PBS à un volume final de 5 ml et remettez la pastille en suspension. Poursuivez le protocole avec l’étape 1.2.5.
5. Centrifugez les tubes comme décrit à l’étape 1.2.2.
6. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 2 mL de 1x PBS. Les cellules sont maintenant prêtes à l’emploi.
REMARQUE : La densité de la suspension de cellules bactériennes n’est pas critique mais doit être suffisante pour la visualisation dans le dégradé. Un DO minimumde 600 (densité optique à 600 nm) de 4 est suggéré.