Séparation des bactéries par quantité de capsule à l’aide d’un gradient de densité discontinu

Résumé

Source : Feltwell, T., et.al. Séparation des bactéries par quantité de capsules à l’aide d’un gradient de densité discontinu. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre l’utilisation d’un gradient de densité discontinu pour séparer les souches bactériennes en fonction de la quantité de capsules. En centrifugeant une banque de mutants transposons à travers le gradient, les bactéries avec des densités de capsule différentes se localisent dans des couches distinctes. Les fractions séparées peuvent ensuite être collectées pour une analyse en aval.

Protocole

1. Ajout de cellules préparées aux gradients et séparation par centrifugation

1. Ajoutez 600 μL de cellules préparées au sommet du gradient dans le tube très lentement et sans mélanger l’interface.
2. Placez les tubes dans des adaptateurs de tube et pesez les adaptateurs et les tubes combinés pour vous assurer qu’ils sont équilibrés.
   1. Place les adaptateurs de tube dans un rotor à angle fixe à l’intérieur d’une centrifugeuse de paillasse. Centrifugeuse pendant 30 min à 3 000 x g.
   2. Après la centrifugation, retirez soigneusement les tubes, placez-les dans un rack approprié et photographiez les résultats sous forme d’enregistrement.
3. Récupérer les fractions bactériennes pour la quantification de l’acide urinaire ou l’extraction de l’ADN.
   1. Si des applications en aval ne sont pas nécessaires, éliminez les échantillons/gradients par la voie appropriée de déchets biologiques liquides dans le laboratoire.
      REMARQUE : Il est important de valider la séparation pour les nouvelles espèces/souches de bactéries. Les fractions individuelles du gradient doivent être examinées au microscope, par dosage de l’acide uronique ou par un autre dosage quantitatif approprié pour confirmer le phénotype de la capsule de chaque fraction. Si l’objectif est de séparer en fonction de l’agrégation ou de la taille des cellules, des tests indépendants appropriés doivent être utilisés.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Centrifugeuse 5810R avec rotor A-4-81 et seaux de 500ml	Eppendorf	5810 718.007
Adaptateurs pour tubes de 15 ml	Eppendorf	5810 722.004
Rotor à coude fixe F-34-6-38	Eppendorf	5804 727.002
Adaptateur de tube 2.6 - 7 ml	Eppendorf	5804 739.000
Centrifugeuse 5424 avec rotor FA-45-24-11	Eppendorf	5424 000.460
5 ml tube à fond rond en polypropylène	Falcon	352063