Cultiver des bactéries magnétospirillum et évaluer leur comportement magnétotactique

Résumé

Source : Le Nagard, L., et al. Croissance des bactéries magnétotactiques du genre Magnetospirillum : souches MSR-1, AMB-1 et MS-1. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo montre comment cultiver des bactéries Magnetospirillum dans des conditions microaérobies en utilisant des milieux liquides et semi-solides. Il met en évidence la formation d’une bande bactérienne visible à l’interface oxique-anoxique et sa migration vers le haut lorsque l’oxygène s’appauvrit. La vidéo montre également comment évaluer le comportement magnétotactique en observant la nage directionnelle en réponse à un champ magnétique.

Protocole

1. Inoculation de bactéries magnétotactiques (MTB)

REMARQUE : Les cultures des souches AMB-1, MS-1 et MSR-1 peuvent être obtenues commercialement (Table des matériaux).

ATTENTION : Effectuez toutes les étapes suivantes dans des conditions stériles, sous la flamme d’un bec Bunsen.

1. Inoculation des souches MSR-1, AMB-1 et MS-1 en milieu liquide
   1. Scellez un flacon de sérum vide de 125 mL avec un bouchon en caoutchouc butyle et un joint à sertir en aluminium. Insérez deux aiguilles dans la bouteille à travers le bouchon et connectez une seringue à l’une d’elles. Connectez la seringue à un cylindre de O₂ à travers le même type de tube que celui utilisé pour la station N₂.
   2. Laissez O₂ couler à travers la bouteille pendant environ 30 minutes pour vous assurer que tout l’air dans la bouteille est remplacé par O₂. Retirez les deux aiguilles, en laissant une légère surpression dans la bouteille, puis autoclavez. Laissez la bouteille refroidir à température ambiante avant utilisation.
      REMARQUE : Pour gagner du temps, effectuez les étapes 1.1.1 et 1.1.2 pendant la préparation du milieu et autoclavez la bouteille avec le milieu ou les solutions mères.
   3. Stérilisez le haut des bouchons de la bouteille fraîche et de la bouteille O₂ en appliquant quelques gouttelettes de solution d’éthanol à 70 % dessus et en les passant à travers la flamme d’un bec Bunsen.
   4. À l’aide d’une seringue stérile et d’une aiguille, prélevez 1 mL de O₂ du flacon de O₂ et transférez-le dans le flacon de milieu frais. Assurez-vous que l’aiguille est bien ajustée sur la seringue pendant cette étape pour éviter tout air dans la seringue.
   5. Si vous utilisez l’inoculum d’une autre culture cultivée dans une bouteille en verre, stérilisez les bouchons de la bouteille de milieu frais et de l’ancienne bouteille de culture en appliquant quelques gouttelettes de solution d’éthanol à 70 % par-dessus et en les passant à la flamme d’un bec Bunsen. Si vous utilisez l’inoculum d’un tube de culture congelée, laissez-le simplement se réchauffer à température ambiante avec le tube scellé sous la flamme d’un bec Bunsen.
   6. Si vous utilisez l’inoculum d’une autre culture cultivée dans une bouteille en verre, inoculez 1 mL de l’ancienne culture dans le milieu frais. Si vous utilisez l’inoculat à partir d’un stock congelé, inoculez seulement 0,1 mL pour diluer le glycérol ou le diméthylsulfoxyde (DMSO) utilisé dans le processus de congélation. Dans les deux cas, utilisez une aiguille stérile et une seringue stérile.
   7. Incuber la culture à 32 °C et l’inoculer dans un milieu frais après 4 à 7 jours.
2. Inoculation de MSR-1 dans un milieu semi-solide dégradé O₂
   1. Vérifiez que le tube de milieu frais présente une interface oxique-anoxique (OAI) bien définie, matérialisée par une interface rose à incolore.
   2. Si l’inoculum provient d’une autre culture semi-solide à gradient de concentration en O₂, récoltez les bactéries en pipetant 50 μL de la culture à l’aide d’une pointe de pipette stérile placée sur la bande formée par les bactéries. Inoculez lentement ces bactéries à l’OAI dans le milieu frais (interface rose/incolore), en évitant de perturber l’interface. Si l’inoculum provient d’une culture congelée, procédez de la même manière avec 100 μL d’inoculum à la place.
   3. Fermez le tube et laissez les bactéries se développer entre 25 °C et 30 °C. Transférez dans un milieu frais en utilisant la même procédure avant que la bande de bactéries n’atteigne la surface du milieu.

2. Observation de la bactérie

1. Stérilisez le bouchon de la bouteille de culture en appliquant une solution d’éthanol à 70 % dessus et en le faisant passer à travers la flamme d’un bec Bunsen. Pour un milieu semi-solide, ouvrez le tube sous la flamme d’un bec Bunsen. Utilisez une aiguille stérile et une seringue stérile pour extraire les bactéries.
2. Utilisez la méthode de la goutte suspendue8 pour vous assurer que les bactéries sont à la fois magnétiques et mobiles.
   REMARQUE : La microscopie à contraste de phase donne d’excellents résultats, mais n’est pas obligatoire. Des grossissements allant de 10X à 60X conviennent.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
AMB-1	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 700264
MS-1	ATCC	ATCC 31632
MSR-1	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)	DSM 6361
L-cystéine.HCl.H₂O	Sigma-Aldrich	C7880-100G
Seringues 1,0 mL	Fischer scientific	B309659
25G x 1 aiguilles	BD	305125
20 mm joints en aluminium	Wheaton	224223-01
20mm E-Z Sertisseuse	Wheaton	W225303
Bouchons en caoutchouc butyle	Bellco Glass, Inc.	2048-11800
Tubes Hungate	Chemglass (VWR)	CLS-4208-01
Bouchon de septum, 13mm, Hungate	Bellco Glass, Inc.	2047-11600
Tubes de culture en verre	Corning (VWR)	9826-16X

125 mL flacons de sérum Wheaton 223748