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Préparez
- une solution mère ne dépassant pas 1 600 μg/mL de dalbavancine dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO) pur (pur) dans des tubes stériles en verre ou en plastique, et utilisez-le le même jour de préparation ou conservez-le à -20 à -60 °C ou moins pour une utilisation future dans un congélateur sans dégivrage. Tenez compte de l’activité de la dalbavancine telle qu’elle figure sur la documentation reçue avec la poudre lors de la pesée de la poudre.
- Diluez la dilution de la crosse de la même manière que le schéma avec du DMSO pur dans des tubes stériles en verre ou en plastique. Utilisez une pipette pour mesurer le diluant et une autre pour ajouter la première crosse de dalbavancine dans le premier tube. Pour chaque concentration ultérieure de stock de dalbavancine, utilisez une nouvelle pipette.
- Préparer des dilutions finales de la concentration du panel de CMI 100X (concentrations intermédiaires) avec du DMSO pur. Combiner les volumes appropriés de source et de DMSO pour obtenir la concentration intermédiaire souhaitée (les volumes à utiliser dépendront du nombre de panneaux de CMI à fabriquer).
- Préparez une solution mère fraîche de P80 à 0,004 % : Préparez une solution mère fraîche de P80 à 2 % en ajoutant 0,1 mL de P80 à 4,9 mL de dH₂O. Stérilisez en passant à travers un filtre de 0,22 μm et utilisez la solution le jour même de la préparation. Préparez un diluant P80 à 0,004 % en diluant à 1:500 avec du P80 à 2 % (p. ex., entre 0,3 mL de P80 à 2 % et 149,7 mL de CAMHB).
- De plus, diluez les concentrations intermédiaires à 1:100 dans du bouillon Mueller Hinton ajusté aux cations (CAMHB) complété par 0,004 % (v/v) de polysorbate-80 (P-80) et/ou de LHB (pour les streptocoques) ajoutés au double de la concentration finale, car l’ajout d’inoculum entraînera une dilution de 1:2.
2. Préparer les panneaux MIC
- Distribuer 50 μL de chaque solution de dalbavancine préparée dans les puits appropriés du panneau MIC et inclure le milieu dans un seul puits (puits de contrôle de croissance). Une pipette multicanaux avec des pointes stériles peut être utilisée pour cette étape.
- Utilisez immédiatement les panneaux ou fermez-les avec un film plastique, placez-les dans des sacs en plastique et placez-les immédiatement dans un congélateur non dégivrable à ≤ -20 °C (de préférence à ≤ -60 °C) jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Si des panneaux congelés sont utilisés, retirer les joints et placer les panneaux individuels sur la paillasse du laboratoire pendant 15 à 30 minutes (jusqu’à ce que le contenu du puits soit décongelé) avant de procéder à l’inoculation des panneaux.
3. Inoculer des panels MIC, effectuer la pureté et configurer le comptage des colonies
- Sélectionnez plusieurs colonies bien isolées à partir d’une gélose au sang de 18 à 24 heures ou d’une autre plaque de gélose non sélective. Touchez le haut de chaque colonie à l’aide d’une boucle ou d’un écouvillon stérile et transférez-le dans 1 à 5 ml de CAMHB ou de solution saline jusqu’à ce que la turbidité soit équivalente à un étalon McFarland de 0,5. Évaluez la turbidité par comparaison visuelle avec le McFarland 0,5 ou à l’aide d’un appareil photométrique.
- Dans les 15 à 30 minutes suivant la préparation, diluer l’inoculum à l’échelle 1:100 dans du CAMHB (100 μL dans 10 mL de CAMHB). Pour la plupart des bactéries testées contre la dalbavancine, à l’exception de S. pneumoniae, cette dilution fournira une concentration finale de puits de 5 × 10 UFC/mL (la plage acceptable est de 2 à 8 × 10 UFC/mL). Pour S. pneumoniae, la concentration bactérienne basée sur une comparaison de la turbidité à un McFarland de 0,5 est généralement considérablement inférieure. Par conséquent, diluer l’inoculum 1:25 (400 μL dans 10 mL de CAMHB + 10 % de LHB).
- Dans les 15 minutes suivant la préparation de l’inoculum, transférer 50 μL de l’inoculum final dans chaque puits (à l’exception du puits de contrôle de la stérilité) du panel de CMI préparé. Une pipette multicanaux utilisant des pointes stériles peut être utilisée pour cette étape.
- Effectuer un contrôle de pureté en transférant et en étalant une aliquote de 1 à 10 μL du puits témoin de croissance positive à l’aide d’une boucle stérile dans une gélose non sélective (p. ex., gélose de soja trypticase avec 5 % de sang de mouton).
- Établissez le dénombrement des colonies en prélevant 10 μL du puits témoin de croissance à l’aide d’une pipette monocanal et d’un embout stérile, puis en transférant dans 10 mL de solution saline (dilution 1:1 000). Mélanger et transférer 100 μL à l’aide d’une pipette monocanal et d’un embout stérile dans un milieu gélosé non sélectif approprié (p. ex., gélose trypticase de soja avec 5 % de sang de mouton) et étaler sur toute la surface de la gélose à l’aide d’une boucle stérile, en répétant deux fois dans des directions différentes pour assurer une distribution uniforme de l’inoculum (dilution 1:10).
4. Incuber les panneaux MIC, le nombre de colonies et les plaques de pureté
- Scellez chaque panneau MIC ou pile de pas plus de quatre panneaux dans un sac en plastique avec du ruban adhésif en plastique ou avec un couvercle en plastique bien ajusté avant l’incubation. Vous pouvez également placer un panneau MIC vide sur le dessus de la pile de 4 panneaux MIC maximum, placer une serviette en papier humide dans un récipient en plastique, placer les panneaux MIC dans le récipient en plastique et fermer le récipient en toute sécurité avec un couvercle. Incuber les panneaux de CMI dans un incubateur d’air ambiant à 35 °C ± 2 °C pendant 16 à 20 heures (staphylocoques et entérocoques) et 20 à 24 heures (streptocoques) dans les 30 minutes suivant l’inoculation. Incuber les plaques de comptage des colonies et de pureté dans les mêmes conditions, à l’exception des streptocoques dans un incubateur à 5 % de CO₂.
5. Lire les plaques MIC et Colony Count ; Lire
- la CMI comme la concentration la plus faible qui inhibe complètement la croissance bactérienne dans les puits détectée à l’œil nu.
- Comptez les colonies sur la plaque de comptage des colonies. Multipliez chaque colonie par le facteur de dilution (1:10 000) (p. ex., 50 colonies équivalent à 5 × 10⁵ UFC/mL). Une fourchette acceptable est de 20 à 80 colonies (2 à 8 × 10⁵ UFC/mL) et est utilisée à titre indicatif approximatif.
- Vérifiez la plaque de pureté. Si toutes les colonies sont similaires à chaque colonie, alors l’inoculum peut être considéré comme pur. S’il y a d’autres colonies présentes, il est possible qu’un contaminant soit présent dans le panneau de CMI, et l’essai doit être répété.