Visualisation médiée par des nanoparticules du remodelage endo-lysosomal dans des cellules infectées par des bactéries

Résumé

Source : Zhang, Y., et al. Application de nanoparticules fluorescentes pour étudier le remodelage du système endo-lysosomal par des bactéries intracellulaires. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo démontre l’utilisation de nanoparticules fluorescentes pour visualiser le remodelage endo-lysosomal dans les cellules épithéliales humaines infectées par des bactéries intracellulaires. À la suite d’une invasion bactérienne, les agents pathogènes manipulent le cytosquelette de l’hôte et le système endo-lysosomal, formant des vacuoles avec des projections tubulaires qui modifient le transport des vésicules. Des nanoparticules marquées par fluorescence sont ensuite utilisées pour suivre ces changements, ce qui permet d’obtenir une imagerie à haute résolution des événements de trafic intracellulaire induits par des agents pathogènes.

Protocole

1. Culture de cellules HeLa
   1. Les cellules HeLa exprimant en permanence LAMP1-GFP (Lysosome-associated membrane glycoprotein 1-Green fluorescent protein) sont cultivées dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco, ou DMEM avec 10 % de sérum de veau fœtal (FCS) et cultivées à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % de CO₂.
   2. Ensemencez les cellules à une densité de 50 000 par puits dans une lame de chambre à 8 puits (Ibidi) et incubez pendant la nuit (O/N).
2. Culture de bactéries
   1. Utiliser la souche sérovar Typhimurium NCTC 12023 de Salmonella enterica de type sauvage (WT). À titre de comparaison, utilisez les souches mutantes ΔssaV défectueuses dans le SPI2-T3SS et ΔsifA dépourvues de l’effecteur clé SifA pour le SIF. Utiliser des souches hébergeant le plasmide pFPV25.1 pour l’expression constitutive de la GFP améliorée.
      REMARQUE : Les souches bactériennes sont systématiquement cultivées dans un bouillon Luria-Bertani (LB) avec l’ajout de 50 μg/ml de carbénicilline (WT) et LB avec l’ajout de 50 μg/ml de carbénicilline et/ou de 50 μg/ml de kanamycine (ΔssaV, ΔsifA) nécessaires au maintien des plasmides.
   2. Inoculer une seule colonie de bactéries dans 3 ml de LB avec des antibiotiques appropriés et cultiver O/N à 37 ºC dans des conditions d’agitation pour l’aération, puis diluer 1:31 dans de la LB fraîche et poursuivre la croissance pendant 3,5 heures. À ce stade, les cultures atteignent la phase logarithmique tardive et les bactéries sont très envahissantes. Un « tambour à rouleaux » est pratique pour incuber des cultures en éprouvette avec aération.
3. Infection des cellules HeLa par des nanoparticules de Salmonella et de Gold-BSA-Rhodamine ou NPs Marquage par chasse à impulsions (voir la figure 1 pour le schéma)
   1. Mesurer la DO₆₀₀ de la bactérie sous-cultivée et diluer à_{DO 600} = 0,2 dans 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate ou PBS (~3 × 10⁸ cfu/ml), ajoutez des quantités appropriées de bactéries aux cellules HeLa dans des lames de chambre à 8 puits pour obtenir une multiplicité d’infection (MOI) de 100.
   2. Incuber pendant 30 minutes dans l’incubateur cellulaire, laver 3 fois avec du PBS pour éliminer les bactéries non internalisées (ce point a été fixé à 0 heure après l’infection, ou 0 heure par an). Ajouter 300 μl de milieu de culture frais contenant 100 μg/ml de gentamicine et maintenir pendant 1 h. Remplacez ensuite le milieu par un milieu frais contenant 10 μg/ml de gentamicine pour le reste du temps d’incubation.
   3. Après l’incubation avec un milieu de culture contenant 100 μg/ml de gentamicine pendant 1 heure, le milieu est remplacé par un milieu d’imagerie (MEM d’Eagle sans FCS, L-glutamine, rouge de phénol et bicarbonate de sodium, avec 30 mM HEPES, pH 7,4) contenant 10 μg/ml de gentamicine. Des NP d’or-BSA-rhodamine sont ajoutées aux cellules HeLa pour obtenir une concentration finale de_{OD 520} = 0,1. (Albumine sérique bovine, ou BSA)
      REMARQUE : Les NP Gold-BSA-rhodamine peuvent également être ajoutés aux cellules avant l’infection, ou à divers moments p.i.
   4. Après 1 heure d’incubation, retirer le milieu, laver 3 fois avec du PBS et ajouter 300 μl de milieu d’imagerie frais contenant 10 % de FCS et 10 μg/ml de gentamicine pour le reste du temps d’incubation.
      REMARQUE : La durée de l’incubation peut varier en fonction de la concentration de NP et de lignées cellulaires utilisées. Pour les macrophages RAW264.7, nous avons observé qu’une incubation de 30 minutes avec des NPs à une concentration de_{OD 520} = 0,05 permettait une internalisation suffisante.

Résultats

Figure 1. Schéma de préparation de cellules HeLa pour l’imagerie de cellules vivantes. Les cellules HeLa ont été ensemencées dans des lames de chambre, faussement infectées ou infectées par diverses souches de Salmonella pend...

Matériaux