Culture de Mycobacterium tuberculosis dans des conditions limitées en fer

Résumé

Source : Gupta, S., et al. Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires produites par des mycobactéries limitées en fer. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre la procédure de culture de Mycobacterium tuberculosis dans des conditions limitées en fer pour induire un stress en fer et favoriser la sécrétion de sidérophores qui favorisent la survie bactérienne.

Protocole

1. Cultiver des mycobactéries dans des conditions limitées en fer

1. Décongeler 50 μL d’un stock congelé de 15 % de glycérol de Mtb (Mycobacterium tuberculosis) et faire passer une gélose sur plaque enrichie avec 10 % d’ADN (albumine – dextrose – NaCl) (5 g/L d’albumine, 2 g/L de dextrose et 0,85 g/L de chlorure de sodium, 0,2 % de glycérol et 0,05 % de Tween-80). Incuber la plaque à 37 °C jusqu’à ce que les colonies soient visibles.
2. Inoculer une seule colonie de Mtb dans 2 mL de milieu de bouillon mycobactérien (Table des matières) complété par un enrichissement en ADN. Incuber avec agitation à 37 °C.
3. Laissons la culture Mtb croître jusqu’à la phase logarithmique tardive (OD₅₄₀ est ~0,8). Pour le vérifier, mesurez l’OD₅₄₀ à l’aide d’un spectrophotomètre.
4. Étaler 200 μL de la culture logarithmique tardive sur les plaques de gélose mycobactérienne (Table des matériaux) complétées par 0,2 % de glycérol, 0,05 % de Tween-80 et de l’ADN. Inoculez au moins 5 plaques. Incuber les plaques à 37 °C jusqu’à ce que la croissance bactérienne soit visible sous forme de couche confluente. Cela prend ~1 semaine pour le VTT.
5. Mouillez un coton-tige stérile dans LIMM (moyen minimal à faible teneur en fer). Utilisez cet écouvillon pour prélever les bactéries des plaques de gélose et inoculer 100 mL de LIMM pour préparer une suspension bactérienne concentrée avec une DO₅₄₀ de ~1,0.
6. Diluez cette suspension 10 fois à 1 L avec LIMM et divisez-la dans deux flacons en plastique stériles de 2 L, contenant chacun 500 ml de culture.
7. Retirer 2 ml de culture et le transférer dans un tube de culture de 5 ml. Ajouter 10 μL de tyloxapol à 10 % vol/vol.
8. Incuber les cultures à 37 °C pendant 14 jours.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Gélose Middlebrook 7H10	BD Difco	262710	Plaques de gélose mycobactérienne
Middlebrook 7H9 Bouillon	BD Difco	271310	Milieu de bouillon mycobactérien
Tube à centrifuger en polypropylène à paroi mince 13x15 mm	Beckman Coulter	344059	Tube à centrifuger en polypropylène à paroi mince 13x15 mm
Flacons de filtration sous vide	CellPro (en anglais)	Réf. V50022	Unité de filtration