Isolement de vésicules extracellulaires contenant des sidérophores de Mycobacterium tuberculosis

Résumé

Source : Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires produites par des mycobactéries limitées en fer. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo démontre l’isolement par étapes de vésicules extracellulaires (VE) de Mycobacterium tuberculosis cultivées dans des conditions limitant le fer qui imitent l’environnement de l’hôte. Il décrit l’utilisation de l’ultrafiltration, de la centrifugation différentielle et de la séparation par gradient de densité pour enrichir et identifier les fractions contenant des VE.

Protocole

1. Collecte de vésicules extracellulaires mycobactériennes (MEV)

1. Mesurer la DO₅₄₀ de la culture de 2 mL au moment du prélèvement. Effectuer des dilutions en série de 1:10 de la culture et déposer 100 μL de chaque dilution sur des plaques de gélose avec de l’ADN et 0,05 % de Tween-80.
2. Transvaser la culture dans cinq tubes à centrifuger coniques de 225 mL et centrifuger à 2 850 x g pendant 7 min à 20 °C.
3. Prélever le surnageant de culture à l’aide d’une pipette de 50 mL et le filtrer-stériliser à l’aide d’une unité de filtration de 0,22 μm.

2. Isolement des MEV

1. Transférez le filtrat de culture dans un système d’ultrafiltration à cellules agitées placé à 4 °C et filtrez le concentré à <50 psi à travers une membrane de coupure de 100 kDa jusqu’à ~50 mL.
2. Centrifuger le filtrat de culture concentré à 15 000 x g pendant 15 min à 4 °C et recueillir le surnageant.
3. Centrifuger le filtrat de culture dans des tubes d’ultracentrifugation en polycarbonate à 100 000 x g pendant 2 h à 4 °C.
4. Remettre les pastilles membraneuses en suspension dans un total de 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile par pipetage doux.
5. Mélanger 0,5 mL de la suspension de pastilles obtenue à l’étape 2.4 avec 1,5 mL de solution d’iodixanol à 60 %, ce qui donne une concentration finale d’iodixanol de 45 % en poids/vol. Distribuez ce mélange au fond d’un tube d’ultracentrifugation en polypropylène à paroi mince de 13 mm x 51 mm.
6. Superposez la suspension MEV-iodixanol 45 % avec 1 ml de solutions d’iodixanol à 40 %, 35 %, 30 %, 25 % et 20 % (vol/vol dans PBS) et 1 ml de PBS sur le dessus.
7. Centrifugeuse à 100 000 x g pendant 18 h à 4 °C.
8. Prélever les fractions du gradient de densité de 1 mL en commençant par le haut à l’aide d’une seringue Hamilton de 1 mL.
9. Diluer chaque fraction prélevée à 20 mL avec du PBS et centrifuger à 100 000 x g pendant 2 h à 4 °C.
10. Retirer le surnageant et suspendre la pastille dans 0,5 mL de PBS. Conservez cette pastille à 4 °C.

Matériaux