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1. Souches bactériennes et conditions de culture
NOTE: Les souches bactériennes utilisées dans cette étude étaient Escherichia coli MP1, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve et Bifidobacterium dentium.
1. Dans le cas d’E. coli, à l’aide d’une anse stérile, inoculer des colonies individuelles dans de 250 à 1 000 mL de bouillon Luria-Bertani (LB) et incuber en aérobie dans un incubateur à 300 tr/min et à 37 °C pendant 48 h avant de traiter la culture. Dans le cas de la souche recombinante E . coli MP1 hébergeant p114-mCherryClyluc, ajouter du chloramphénicol à la gélose LB et au bouillon à une concentration finale de 17 μg/mL.
2. Pour A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve et B. dentium, tracer des traînées sur des plaques de gélose de perfusion cerveau-cœur (BHI) et incuber en anaérobie à l’intérieur d’une chambre anaérobie en vinyle. Inoculer des colonies individuelles dans 100 mL de bouillon de BHI pré-réduit et incuber pendant 48 h en anaérobie.
2. Isolation des véhicules électriques
1. Clarification du milieu de culture bactérienne par centrifugation et filtration
1. Transférez les cultures cellulaires bactériennes inoculées à l’étape 1 pour nettoyer les flacons de centrifugeuse en polypropylène de 250 mL ou 500 mL en les versant. Centrifuger les flacons dans un rotor à angle fixe de grande capacité à 4 °C et 5 000 × g pendant 15 min. Transférez le surnageant dans des flacons de centrifugation propres en versant soigneusement, puis centrifugez à nouveau à 10 000 × g pendant 15 min.
NOTE: Réutilisez les bouteilles après un nettoyage et une décontamination adaptés à la biosécurité.
1. Si de grosses pastilles de cellules bactériennes sont présentes après la deuxième centrifugation, répétez la centrifugation dans une bouteille propre pour éliminer davantage les cellules.
2. Transférez le surnageant dans un dispositif de filtration à vide en polyéthersulfone de 0,22 μm de taille appropriée en le versant. Filtrez en connectant le dispositif de filtration à une paroi d’alimentation sous vide. Si le taux de filtration diminue considérablement, il suffit de déplacer tout matériau non filtré vers un nouvel appareil. Conservez le milieu filtré à 4 °C pendant la nuit et continuez le protocole le lendemain si vous le souhaitez.
NOTE: Les centrifugations ci-dessus permettent généralement de traiter ~2 fois le volume indiqué de culture cellulaire à travers chaque appareil. Par exemple, un seul dispositif de filtration de 500 mL pourrait filtrer ~1 000 mL de culture précentrifugée. Ces appareils ne sont généralement pas réutilisés. L’utilisation de filtres à seringue à cette étape n’est pas recommandée sans optimisation, car des pertes importantes ont été constatées avec les modèles testés. Il s’agit d’un point d’arrêt potentiel.
3. Vérifier l’élimination complète des cellules viables à ce stade en étalant une aliquote du surnageant filtré sur des plaques de gélose appropriées et s’assurer de l’absence de colonies après l’incubation dans des conditions optimales pour la souche bactérienne. Si des bactéries sont détectées, optimisez davantage la procédure ci-dessus en effectuant des centrifugations et/ou des filtrations supplémentaires.
2. Concentration du milieu filtré
1. Si vous travaillez avec des volumes de > de 100 ml, passez à l’étape 2.2.2. Si vous travaillez avec des volumes de ~100 ml, chargez 90 ml de milieu de culture filtré dans le réservoir d’un dispositif d’ultrafiltration centrifuge à coupure de poids moléculaire (MWCO) de 100 kDa à l’aide de pipettes sérologiques. Équilibrez toujours à l’aide d’un appareil d’ultrafiltration adapté et centrifugez dans un rotor à godets oscillants à 4 °C et 2 000 × g pendant des intervalles de 15 à 30 minutes, jusqu’à ce que le volume du fluide dans le réservoir supérieur ait été concentré à <0,5 ml.
1. Remplissez le réservoir avec le milieu de culture filtré restant. En cas d'« appoint », retirez le flux au bas de l’appareil et rééquilibrez tous les appareils.
NOTE: Il a été observé que le volume maximal de milieu de culture filtré pouvant être concentré à l’aide de ces dispositifs est <2 fois supérieur au volume recommandé.
2. Si la viscosité du milieu concentré dans le réservoir est visiblement augmentée (matériau sombre et visqueux), diluer avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et reconcentrer par centrifugation pour diluer toutes les protéines non EV inférieures au MWCO de 100 kDa.
NOTE: Il s’agit d’un point d’arrêt potentiel.
3. Transférez le milieu concentré dans un tube à faible teneur en protéines, conservez-le à 4 °C pendant la nuit et continuez le protocole le lendemain si vous le souhaitez.
2. Si vous travaillez avec des volumes d’une puissance de > de 100 ml, choisissez un dispositif de filtration à flux tangentiel (TFF) de taille appropriée (100 kDa MWCO) pour s’adapter au volume à traiter.
NOTE: Des dispositifs de filtration pour le traitement de 100 mL à >1 000 mL sont disponibles dans le commerce. La disponibilité locale, le coût et la compatibilité avec la pompe et les tuyaux/connexions dicteront quels modèles particuliers seront les plus utiles. Jusqu’à 2 L de milieu de culture ont été traités avec l’appareil indiqué dans la table des matériaux avant de devoir nettoyer le filtre (voir l’étape 2.3 ci-dessous pour le protocole de nettoyage).
1. Assemblez un circuit de filtration avec un tube #16 à faible lixiviation, un tuyau ardillon de 1/8 de pouce vers des adaptateurs Luer, le dispositif TFF et une pompe péristaltique.
NOTE: Effectuer des TFF à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité pour minimiser le risque de contamination de la préparation des VE par des bactéries environnementales.
2. À température ambiante, commencer à faire circuler le milieu filtré et conditionné à environ 200 mL/min (minimum 100 mL/min). Déterminer le régime approprié correspondant au débit souhaité en pompant 200 mL de PBS dans un récipient gradué. Lors de la circulation d’un milieu filtré et conditionné, collectez les molécules de <100 kDa traversant la membrane d’ultrafiltration sous forme de déchets dans un récipient séparé.
NOTE: L’exemple ci-dessous suppose un volume de départ de 2 L de culture.
3. Continuez à faire circuler le milieu conditionné jusqu’à ce que son volume ait été réduit à ~ 100-200 ml. Passez à des navires plus petits au besoin. Diluez 2 fois avec du PBS et continuez à circuler avec la pompe, en vous concentrant jusqu’à 75-100 ml. Diluer 2 fois avec du PBS et continuer à circuler jusqu’à un volume final de 25 ml. Diluer 2 fois avec du PBS et continuer à circuler jusqu’à <10 ml.
4. Soulevez le tube d’alimentation du réservoir d’échantillon et continuez à pomper pour purger le filtre et récupérer la quantité maximale d’échantillon.
NOTE: Il s’agit d’un point d’arrêt potentiel.
5. Transférez l’échantillon concentré dans un tube conique et conservez-le toute la nuit à 4 °C si vous le souhaitez. Vous pouvez également continuer avec le protocole.
6. Déplacez l’échantillon concentré dans un dispositif d’ultrafiltration centrifuge MWCO d’une capacité de 15 ml et de 100 kDa. Centrifuger dans un rotor à godets oscillants à 4 °C et 2 000 × g pendant 15 à 30 minutes d’intervalle jusqu’à ce que le volume du fluide dans le réservoir supérieur ait été concentré à <2 mL.
NOTE: Il s’agit d’un point d’arrêt potentiel.
7. Transférez le milieu concentré dans un tube à faible teneur en protéines et conservez-le à 4 °C pendant la nuit, en continuant le protocole le lendemain si vous le souhaitez.