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1. Chromatographie d’exclusion stérique (SEC)
NOTE: La SEC est utilisée pour augmenter la pureté des vésicules extracellulaires (VE) et éliminer les protéines non vésiculaires.
- Utiliser une petite colonne SEC (volume de lit de 10 ml) pour isoler les VE de <100 ml de matériau de départ et une colonne plus grande (volume de lit de 47 ml) pour isoler les VE de >100 ml de matériau de départ.
NOTE: L’exemple ci-dessous répertorie les volumes de la colonne la plus grande, avec les volumes de la plus petite colonne entre parenthèses. - Amenez la colonne SEC et la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à température ambiante pendant plusieurs heures. Stabilisez la colonne SEC en position verticale à l’aide d’un support de laboratoire et d’un support standard. Vous pouvez également utiliser des supports de colonnes de chromatographie commerciaux.
- Avant de le connecter à la colonne SEC, hydratez le réservoir d’échantillon en laissant 5 ml de PBS s’écouler à travers la fritte et dans un récipient à déchets. Dévissez le capuchon d’entrée de la colonne SEC, ajoutez 2 ml de PBS dans le réservoir d’échantillon et connectez soigneusement le réservoir à la colonne pendant que le PBS s’égoutte à travers la fritte (ne s’applique pas aux petites colonnes SEC). NOTE: Cette étape précédente empêche les bulles d’air de se coincer en haut de la colonne SEC. Si de l’air est piégé, retirez le réservoir, tapotez la colonne pour faire sortir la bulle d’air et répétez la procédure de connexion. Pour la plus petite colonne, il suffit de déboucher le haut de la colonne SEC et de fixer la trémie d’échantillon.
- Ajouter 47 ml (10 ml) de PBS dans le réservoir d’échantillonnage et déboucher le bas de la colonne SEC. Laissez tout le tampon d’échantillon chargé circuler dans la colonne pour l’équilibrage. Jetez le flux continu.
- Chargez un maximum de 2 ml (0,5 ml) d’échantillon dans le réservoir d’échantillon, jetez le liquide d’écoulement et laissez l’échantillon entrer complètement dans la colonne.
- Ajouter immédiatement le PBS dans le réservoir d’échantillonnage ou la trémie à un volume de 14,25 mL moins le volume d’échantillon (3 mL moins le volume d’échantillon, pour la petite colonne). Laissez la solution s’écouler à travers la colonne et jetez cette quantité égale au volume de vide de la colonne.
NOTE: Pour un échantillon typique de 2 ml, la quantité de PBS à ajouter dans le réservoir ou la trémie d’échantillon sera de 12,25 ml. - Placez un microtube de 2 mL à faible liaison directement sous la colonne SEC. Ajouter immédiatement 2 ml (0,5 ml) de PBS dans le réservoir d’échantillon et le laisser entrer dans la colonne. Étiqueter les premiers 2 mL (0,5 mL) de liquide d’écoulement comme étant la fraction 1. Continuez à ajouter 2 ml (0,5 ml) à la fois dans le réservoir d’échantillon pour recueillir chaque fraction subséquente.
NOTE: La plupart des VE bactériennes éluent dans les 5 premières fractions. Lors de l’optimisation, les 12 premières fractions ont été collectées. - Stockez les fractions à 4 °C pour un stockage à court terme (jours) ou à -80 °C pour un stockage à long terme.