Transinfection bactérienne in vitro des lymphocytes T par formation de synapses immunologiques

Résumé

Source : Cruz-Adalia, A., et al. Les lymphocytes T capturent les bactéries par transinfection à partir de cellules dendritiques. J. Vis. Exp. (2016).

Cette vidéo démontre la transinfection bactérienne par le biais d’interactions entre les lymphocytes T et les cellules dendritiques spécifiques de l’antigène. Les cellules dendritiques infectées par des bactéries présentant un peptide d’ovalbumine sont incubées avec des lymphocytes T, soit directement, soit séparés par une membrane. Le contact direct permet la formation de synapses immunologiques, permettant le transfert bactérien, tandis que la membrane empêche l’interaction. Un traitement à la gentamicine est ensuite effectué pour éliminer les bactéries extracellulaires.

Protocole

Remarque : Les souris ont été élevées dans un logement exempt d’agents pathogènes spécifiques (FPS) et elles ont été euthanasiées par du personnel formé et qualifié à l’aide de la méthode d’inhalation de dioxyde de carbone (CO₂).
1. Différenciation et infection des cellules dendritiques (DC) dérivées de la moelle osseuse de sourisRemarque : La figure 1 résume cette première étape. À partir de ce moment, toutes les procédures doivent être effectuées dans la hotte, en utilisant uniquement des milieux stériles, des instruments, des pointes de pipette et des boîtes de culture.

1. Différenciation des DC dérivés de la moelle osseuse de souris
   1. Disséquez les tibias et les fémurs d’une souris C57/BL6 et transférez-les dans un plat en plastique avec 10 ml de milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
   2. Coupez chaque épiphyse avec des ciseaux stériles et exposez la moelle osseuse, qui a une couleur rouge vif caractéristique.
   3. Perfuser l’intérieur de l’os avec 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 5 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (tampon PBS/BSA/EDTA) à l’aide d’une seringue stérile sur une boîte de Pétri stérile.
   4. Recueillir la suspension cellulaire et centrifuger dans un tube à 600 x g dans une centrifugeuse réfrigérée (4 °C).
   5. Remettre les cellules en suspension dans 1 ml de tampon de lyse ammoniaque-potassium (ACK) (chlorure d’ammonium 0,15 M (NH₄Cl), bicarbonate de potassium 10 mM (KHCO₃) et EDTA 0,1 mM) et incuber pendant 30 secondes à température ambiante (RT) afin d’éliminer les globules rouges.
   6. Ajouter 10 ml de milieu RPMI 1640 avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et filtrer à travers une passoire cellulaire (70 μm) pour éliminer les fragments d’os et les amas cellulaires avant de centrifuger à la même vitesse (600 xg) car les amas ont été éliminés par filtration.
   7. Comptez les cellules et ajustez à 5 x 10⁵ cellules/ml avec du RPMI 10 % FBS (contenant 50 μM de B-mercaptoéthanol, 1 mM de pyruvate de sodium) et ajoutez 20 ng/ml de facteur de stimulation des colonies de granulocytes murins recombinants et de macrophages (rm-GM-CSF) comme concentration finale.
   8. Ajouter cette suspension à une boîte de Pétri stérile de qualité microbiologique de 15 cm et la faire cultiver dans un incubateur de CO₂ (37 °C, 5 % de CO₂).
   9. Tous les trois jours, faire descendre les cellules non adhérentes et les cellules détachées avec 5 mM d’EDTA dans du PBS et remettre en suspension à 5 x 10⁵ cellules/ml de densité cellulaire, avec un milieu frais contenant 20 ng/ml de rm-GM-CSF.
2. Maturation des CD et charge d’antigènes
   1. Au jour 9, remettre en suspension les cellules à une densité de 5 x 10⁵ cellules/ml dans un milieu contenant 20 ng/ml de rm-GM-CSF. Ensuite, ajoutez 20 ng/ml de lipopolysaccharide (LPS) pour permettre une expression élevée du complexe majeur d’histocompatibilité ou du CMH-II sur les cellules et incubez dans une boîte de Pétri stérile de 15 cm non traitée par culture tissulaire pendant 24 heures.
   2. Après une journée de stimulation par LPS, colorez certaines cellules DC avec des anticorps contre CD11c, MHC-II et le récepteur des granulocytes 1 ou Gr-1 de souris pour vérifier la différenciation des DC par cytométrie en flux. Les figures 3A et 3B illustrent un exemple d’analyse par cytométrie en flux des DC.
      1. Incuber des DC (5 x 10⁵ cellules/échantillon) avec un anticorps monoclonal anti-souris CD16/CD32 à 2,5 μg/ml de concentration finale dans 50 μl de tampon PBS/BSA/EDTA par échantillon. Ensuite, ajoutez 50 μl d’anticorps contre MHC-II (I-A/I-E), CD11c et Gr-1 conjugués à différents fluorochromes à 1:100, 1:200 et 1:500 dans le tampon PBS/BSA/EDTA, respectivement.
      2. Enfin, laver les DC avec un tampon PBS/BSA/EDTA et les analyser par cytométrie en flux selon le protocole du fabricant.
         Remarque : Si les cellules sont bien différenciées, elles sont prêtes pour la charge d’antigènes.
   3. Laver les DC avec du RPMI 10 % FBS (sans antibiotiques) et les incuber avec 10 μg/ml de peptide OTII d’ovoalbumine (OVAp) (OVA 323-339 ; I S Q A V H A A H A E I N E A G R) sur un tube en plastique dans 1 ml de milieu RPMI 10 % FBS par 5 x 10⁶ DC pendant un minimum de 1 heure à 37 ºC. En tant que contrôle négatif, quittez les DC sans incuber avec OVAp.
3. Infection des DC
   1. Infecter les DC à une multiplicité d’infection (MOI) de 10 bactéries (10 bactéries par DC) pendant 1 heure dans un incubateur de CO₂ (37 °C, 5 % de CO₂).
   2. Laver les cellules DC 3x en PBS et 1x en RMPI 10 % FBS et centrifuger à 450 x g afin de laver la plupart des bactéries extracellulaires. Enfin, remettre les cellules en suspension dans un milieu RMPI 10 % FBS (sans antibiotiques) à 20 x 10⁶ cellules/ml.

2. Isolement des lymphocytes T CD4⁺ de souris transgéniques OTIIRemarque : La figure 1 résume cette deuxième étape. Les ganglions lymphatiques doivent être utilisés à la place de la rate pour isoler les lymphocytes T CD4⁺ , car la proportion de lymphocytes CD4⁺ dans les ganglions lymphatiques (~50 %) est plus importante que dans la rate (~25 %) et donc la purification serait plus efficace.

1. Réaliser une suspension unicellulaire de ganglions lymphatiques
   1. Retirez les ganglions lymphatiques inguinaux, axillaires, brachiaux, cervicaux et mésentériques de souris transgéniques OTII et transférez-les dans une boîte en plastique avec 10 ml de milieu RPMI 10 % FBS.
   2. Broyez les ganglions lymphatiques sous un capuchon stérile à l’aide de deux lames de microscope givrées. Placez les ganglions lymphatiques sur un côté givré d’une lame de microscope et frottez avec le côté givré de la deuxième lame jusqu’à ce que les organes aient été broyés.
   3. Laver la suspension unicellulaire dans un tampon PBS/BSA/EDTA.
   4. Filtrez les cellules à travers une passoire cellulaire (70 μm) pour éliminer le tissu conjonctif et lavez-les avec un tampon PBS/BSA/EDTA.
   5. Remettre les cellules en suspension dans 1 ml de tampon de lyse ACK et incuber pendant 1 min à la RT afin d’éliminer les globules rouges.
2. Isolement des lymphocytes T CD4⁺
   1. Laver à nouveau comme à l’étape 2.1.3 et compter les cellules pour les remettre en suspension à 100 x 10⁶ cellules/ml dans le tampon PBS/BSA/EDTA. Ajoutez des anticorps biotinylés contre les CD8, IgM, B220, CD19, CMH de classe II (I-Ab), CD11b, CD11c et DX5 à 1:250 pendant 30 min sur glace pour une sélection négative ultérieure des lymphocytes T CD4⁺ .
   2. Laver les cellules dans un tampon PBS/BSA/EDTA et incuber les cellules (100 x 10⁶ cellules/ml) avec des microbilles de streptavidine à la concentration recommandée dans le protocole du fabricant pendant 15 min sur de la glace.
   3. Lavez les cellules dans un tampon PBS/BSA/EDTA et filtrez-les à travers une crépine cellulaire (30 μm) avant l’isolement des lymphocytes T CD4⁺ .
   4. Isolez les lymphocytes T CD4⁺ par sélection négative à l’aide d’une machine de séparation magnétique des cellules selon le protocole du fabricant.
   5. Comptez les cellules et ajustez à 4 x 10⁶ cellules/ml avec un milieu RPMI 10 % FBS (sans antibiotiques).
   6. Fixez et conservez sur la glace des lymphocytes T CD4⁺ isolés (3 x 10⁵ cellules) pour vérifier la pureté par cytomètre en flux. La figure 3C illustre un exemple de purification de lymphocytes T CD4⁺.

3. Mesure de la transinfection des lymphocytes T par un test de protection contre la gentamicineRemarque : La figure 2 résume cette troisième étape du protocole.

1. Transinfection des lymphocytes T

1. Incuber des lymphocytes T CD4⁺ isolés avec des cellules DC infectées (1:1) (les DC ont été infectées pendant 1 heure et lavées pour éliminer les bactéries libres) pendant 30 minutes pour permettre la formation de synapses immunitaires dans un incubateur de CO₂ (37 °C, 5 % de CO₂).

2. Ajouter 0,5 ml de lymphocytes T CD4⁺ isolés (2 x 10⁶ cellules) et 0,1 ml de CD infectés (2 x 10⁶ cellules) sur une plaque de culture à 24 puits. En tant que témoin négatif, infecter directement 0,5 ml de lymphocytes T CD4⁺ à un moment d’inertie de 10 bactéries pendant 30 min.

3. Inclure des contrôles supplémentaires séparant les DC infectés des lymphocytes T à l’aide d’une barrière transwell en polycarbonate (avec une taille de pores de 3 μm), empêchant le contact physique DC-T. Ajouter 0,1 ml de CD à l’intérieur du puits et 0,5 ml de lymphocytes T CD4⁺ dans le compartiment inférieur du puits (plaque à 24 puits).

4. Enfin, complétez avec le milieu RMPI jusqu’à ce qu’il y ait 0,6 ml dans chaque puits pour obtenir des volumes égaux dans tous les échantillons.

5. Après 30 minutes de formation des synapses immunitaires, ajoutez 100 μg/ml de gentamicine et incubez pendant 1 heure avant de prélever des cellules dans un incubateur de CO₂ (37 °C, 5 % de CO₂).

Résultats

Graphique 1. Organigramme de la génération de courant continu et de l’isolement des lymphocytes T CD4⁺ . Sur le côté gauche de la figure, le processus de différenciation des cellules dendritiques (CD) des cellules de la moelle oss...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RPMI	Fisher Scientific	SH3025501
r-GMCSF	Peprotech	315-03
LPS	SIGMA	L2630-10mg
Na Pyruvate	Thermo Scientific	SH3023901
2-MOI	Gibco	31350-010
OVAp OTII (323 à 339)	GenScript	---
Crépine de cellule 70uM	BD	352350
30uM Seringue Filcons Stérile	BD	340598
AutoMacs Classic	Miltenyi Biotec	130-088-887
Gentamicine	Normon	624601.6
Transwell	Costar	3415
LB	Pronadisa	1231
Agar-agar	Pronadisa	1800
Paraformaldéhyde 16 %	Sciences de la microscopie électronique	15710
Triton X-100
CD8 biot	BD Biosciences	553029
IgM Biot	ImmunoStep	Clone RMM-1
B220 Biot	BD Biosciences	553086
CD19 biot	BD Biosciences	553784
CMH-II Biot (I-A/I-E)	BD Biosciences	553622
CD11b biot	Immunostep	11BB-01mg
CD11c biot	Immunostep	11CB3-01MG
DX5 biot	BD Biosciences	553856
Gr-1 biot	BD Biosciences	553125
CD16/CD32	ImmunoStep	M16PU-05MG
anti Salmonella	ABD Serotec	8209-4006
CD11cPE	BD Biosciences	553802
CD4-APC	Tonbo Biosciences	Référence 20-0041-U100
Gr-1 APC	BD Biosciences	553129
MHC-II (I-A/I-E) FITC	BD Biosciences	553623
Alexa-Fluor 647 Anticorps anti-IgG (H+L) de chèvre, hautement adsorbé croisé	Invitrogen	A-21245
CMAC (7-amino-4-chlorométhylcoumarine)	Technologies du vivant	Réf. C2110
BSA	SIGMA	A7030-100G
Microbilles de streptavidine	Miltenyi Biotec	130-048-101
BD FACSCanto II	BD Biosciences	---