Évaluation de l’attachement du pneumocoque aux cellules endothéliales humaines primaires sous un flux de milieu constant

Résumé

Source : Jagau, H. et al. Infection à pneumocoque des cellules endothéliales humaines primitives en flux constant. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre la visualisation en temps réel de l’attachement du pneumocoque aux chaînes du facteur de von Willebrand (VWF) sur les cellules endothéliales dans des conditions de flux de milieu constant. Il décrit les étapes pour stimuler la libération de VWF, étiqueter les cordes et quantifier la liaison bactérienne.

Protocole

1. Induction de la libération du facteur de von Willebrand (VWF) et visualisation de chaînes VWF multimérisées

1. Maintenir le réglage de l’écoulement car une contrainte de cisaillement de 10 dyn/cm² est nécessaire pour déclencher la multimérisation du VWF en longues chaînes allant jusqu’à 200 MDa. Induire la libération de VWF à partir du WPB endothélial en injectant 136 μL d’une solution mère d’histamine de 100 mM dans le milieu de croissance des cellules endothéliales avec mélange de suppléments (ECGMS) circulant dans la tubulure de perfusion à l’aide d’un orifice d’injection. La concentration finale d’histamine dans le fluide d’écoulement sera de 1 mM. S’il n’y a pas d’orifice d’injection, l’histamine peut être ajoutée alternativement par pipetage dans le milieu des réservoirs de la pompe.
2. Pour la détection par immunofluorescence de chaînes VWF multimérisées, arrêtez l’écoulement lorsqu’un niveau de milieu équilibré dans les réservoirs est atteint et injectez 20 μg d’un anticorps conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine spécifique du VWF (FITC) dans un volume de 200 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pH 7,4) dans les 13,6 mL circulants de milieu ECGMS à l’aide d’un port d’injection. S’il n’y a pas d’orifice d’injection, l’anticorps peut être ajouté alternativement par pipetage dans le milieu des réservoirs de la pompe. Il en résulte une concentration finale d’anticorps de 1,3 μg/mL.
3. Pour un balayage microscopique de plusieurs champs de vision en peu de temps, utilisez l’unité de fluorescence du microscope avec un appareil à fluorescence au xénon à 30 % de puissance et une caméra à épifluorescence. Surveillez la forme et la morphologie de la couche de cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) avec le mode de champ clair pour sélectionner des cellules représentatives adaptées à la visualisation des chaînes VWF.
4. Pour visualiser des chaînes VWF fluorescentes vertes, sélectionnez un objectif à huile 63x/1,40 et un filtre de détection 470 nm dans le menu de l’unité de fluorescence du logiciel du microscope (LasX). Créez des instantanés d’empilements Z d’au moins 50 vues de terrain représentatives, chacune contenant environ 10 HUVEC morphologiquement intacts. Pour quantifier les chaînes VWF fluorescentes vertes à différents points temporels, balayez plusieurs champs de vision.

2. Évaluation microscopique de l’attachement bactérien aux chaînes VWF en écoulement en temps réel

1. Quantifier l’attachement du pneumocoque aux chaînes VWF générées à la surface des cellules HUVEC par détection par immunofluorescence.
   1. Maintenez le débit et injectez 1,35 x 10 8 UFC/mL de^pneumocoques exprimant la protéine de fluorescence rouge (RFP) dans un volume maximal de 1 mL dans le milieu ECGMS à l’aide de l’orifice d’injection. Vous pouvez également pipeter les bactéries dans le milieu situé dans le réservoir de la pompe. Redémarrer la contrainte de cisaillement à 10 dyn/cm² pour permettre aux bactéries de circuler dans le système de pompe.
   2. Sélectionnez un objectif à immersion dans l’huile 63x pour le grossissement du microscope et ajustez les paramètres du filtre de fluorescence dans le logiciel du microscope sur le canal RFP (filtre de détection 540 nm) pour la détection des pneumocoques exprimant la RFP.
   3. Pour quantifier l’attachement bactérien aux chaînes VWF, arrêtez le flux et créez des instantanés d’empilements Z d’au moins 30 vues représentatives du terrain, chacune contenant environ 10 HUVEC morphologiquement intacts, et comptez le nombre de pneumocoques.
   4. Utilisez l’algorithme de statistiques monofactorielles ANOVA afin d’évaluer les données, suivi d’un test d’échantillon non apparié bilatéral post-hoc pour une comparaison statistique détaillée. Des valeurs P de <0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

Matériaux