Imagerie par fluorescence de l’infection bactérienne associée aux biomatériaux chez les embryons de poisson-zèbre

Résumé

Source : Zhang, X., et al. Un modèle d’embryon de poisson-zèbre pour la visualisation in vivo et l’analyse intravitale de l’infection à Staphylococcus aureus associée aux biomatériaux. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo démontre l’imagerie par fluorescence d’embryons de poisson-zèbre injectés avec Staphylococcus aureus, permettant de quantifier la progression de l’infection et la distribution bactérienne pour évaluer l’impact des microsphères de biomatériaux sur les interactions hôte-pathogène in vivo.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Microscopie à fluorescence de la progression de l’infection et de l’infiltration cellulaire provoquée chez les embryons de poisson-zèbre

1. Anesthésier les embryons en les plaçant dans une boîte de Pétri de 100 mm contenant 0,02 % (p/v) d’acide 3-aminobenzoïque (tricaïne) pour les anesthésier. Après 5 min, transférez les embryons sur la plaque d’agarose recouverte d’un milieu E3 contenant 0,02 % (p/v) de tricaïne et alignez-les dans une orientation pour l’injection. Pipette de 500 μL d’une solution de méthylcellulose PBS (solution saline tamponnée au phosphate)-2 % (poids) dans une boîte de Pétri contenant un milieu E3 avec 0,02 % (p/v) de tricaïne. Placez les embryons dans la solution de méthylcellulose et maintenez-les droits et horizontaux.
   NOTE: La solution de méthylcellulose est utilisée comme une « colle » qui, en raison de sa viscosité, peut immobiliser temporairement les embryons dans la meilleure orientation pour l’imagerie.
2. Utilisez un microscope à stéréofluorescence équipé de filtres à fond clair, mCherry, à protéine fluorescente verte (GFP) et UV (ultraviolet) pour imager des embryons individuels sous des paramètres optimisés identiques (par exemple, intensité, gain et temps d’exposition) à un grossissement de 160x. Réglez le plan focal de manière à ce que les lésions tissulaires causées par l’injection soient nettes, à l’aide du filtre à fond clair. Réglez la profondeur de l’empilement Z à 10 μm et la taille du pas à 5 μm, ce qui permet d’enregistrer 3 images consécutives.
3. Imagez des embryons individuels une fois par jour de 5 h après l’injection jusqu’à 2 jours après l’injection. Exclure les embryons morts (pas de battement de cœur ou embryon partiellement dégradé) pour une imagerie et une analyse plus poussées. Conservez les embryons individuellement dans un milieu E3 dans des plaques de 48 puits. Rafraîchissez le support quotidiennement.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microsphères de polystyrène de 10 μm de diamètre (bleu fluorescent)	Technologie du vivant/ThemoFisher	F8829
Acide 3-aminobenzoïque (tricaïne)	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Microscope stéréo fluorescent LM80	Leica	MDG3610450126
Méthylcellulose 4000cp	Sigma-Aldrich	MO512-250G
Boîte de Petri	Faucon	353003
Boîte de Petri	Biomérieux	NL-132
ImageJ	Sans objet	Sans objet	Lien : https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Bloc-notes graphique 7.0	Prisme	Sans objet