Analyse in vivo d’infections bactériennes associées à des implants à l’aide d’embryons de poisson-zèbre

Résumé

Source : Zhang, X. et. al., Un modèle d’embryon de poisson-zèbre pour la visualisation in vivo et l’analyse intravitale de l’infection à Staphylococcus aureus associée aux biomatériaux. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo présente un modèle d’embryon de poisson-zèbre pour étudier les infections liées aux biomatériaux implantés. L’injection de microsphères de polystyrène à Staphylococcus aureus améliore la survie bactérienne, confirmant le rôle de promotion des infections des matériaux implantés.

Protocole

1. Préparation de suspensions de bactéries uniquement et de microsphères de bactéries

NOTE: La souche Staphylococcus aureus RN4220 exprimant la protéine fluorescente mCherry (S. aureus-mCherry) est utilisée. La souche RN4220 de S. aureus est mutée dans le gène régulateur de virulence agrA (régulateur de gène accessoire A) et, par conséquent, peut avoir une virulence relativement faible dans le modèle embryonnaire de poisson-zèbre. D’autres souches de S. aureus ou d’autres espèces bactériennes pour l’infection associée aux biomatériaux (BAI) peuvent être utilisées.

1. Prélever 4 à 5 colonies de bactéries S. aureus RN4220 à partir de plaques de culture de gélose tryptique au soja additionnées de 10 μg/mL de chloramphénicol et cultiver les bactéries jusqu’à la phase de croissance logarithmique moyenne dans 10 mL de bouillon de soja tryptique complété par 10 μg/mL de chloramphénicol à 37 °C sous agitation.
   1. Pendant la culture, diluer 100 μL de la suspension bactérienne dans 900 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile dans une cuvette (largeur de 1 cm) pour une mesure de la densité optique (DO) à 620 nm (OD₆₂₀). Cultivez les bactéries jusqu’à ce que la DO₆₂₀ atteigne 0,4 à 0,8.
      NOTE: Une DO₆₂₀ de 0,1 correspond généralement à 3,0 x 10⁷ unités formant colonies (UFC)/mL de S. aureus. La DO₆₂₀ d’un inoculum de bactéries en phase de croissance logarithmique moyenne est comprise entre 0,4 et 0,8. Des périodes de culture différentes peuvent être nécessaires pour d’autres espèces et souches de bactéries.
2. Centrifugez les bactéries à 3 500 x g pendant 10 min et remettez en suspension les bactéries granulées dans 1 mL de PBS stérile. Par la suite, laver les bactéries avec du PBS stérile 2 fois, et enfin remettre les bactéries en suspension dans 1,1 mL de solution de polyvinylpyrrolidone40 (PVP40) à 4 % (p/v) dans du PBS.
3. Vortex cette suspension bactérienne et diluer 100 μL de la suspension dans 900 μL de PBS stérile dans une cuvette pour la mesure de l’OD₆₂₀ . Ajustez la concentration de la suspension bactérienne avec la solution PVP40. Il s’agit de la suspension « Bacteria-only ».
4. Les biomatériaux peuvent être librement choisis pour être mélangés à la suspension bactérienne. Dans la présente étude, des microsphères de polystyrène (PS) commerciales (fluorescentes bleues, 10 μm) sont utilisées. Pour générer une suspension de microsphères de bactéries, centrifugez les microsphères pendant 1 min à 1 000 x g, à température ambiante, jetez le surnageant et remettez les microsphères en suspension dans la suspension « Bactéries uniquement » (dans une solution PVP40).
5. Afin d’injecter des doses à peu près égales de bactéries en présence et en l’absence de microsphères, la concentration de la suspension Bactéries-Microsphères doit être égale aux deux tiers de la concentration de la suspension « Bactéries uniquement » (sans microsphères). Ceci est réalisé en diluant la suspension Bacteria-Microspheres avec 0,5 volume de solution PVP40. Mélanger les suspensions par vortex. Il convient de noter que ce rapport (les deux tiers) a été évalué pour S. aureus. Il convient également à S. epidermidis, mais il est conseillé de vérifier si ce rapport s’applique également à d’autres espèces bactériennes et à d’autres tailles (plus de 10 μm) ou formes de biomatériaux (que les microsphères) à injecter.
6. Vérifier la concentration de la suspension « Bactéries uniquement » et Bactéries-Microsphères par culture quantitative de dilutions en série de 10 fois comme ci-dessous : transférer 100 μL des suspensions dans une plaque à 96 puits et diluer en série en transférant 10 μL d’aliquotes de la suspension dans 90 μL de PBS stérile. Duplication sur plaque d’aliquotes de 10 μL de suspensions non diluées et diluées sur des plaques d’agarose, incubation des plaques à 37 °C pendant la nuit, comptage des colonies et calcul du nombre de bactéries (unités formant colonies, UFC).

2. Reproduction, récolte et entretien des embryons de poisson-zèbre

1. Suivez les procédures générales de reproduction, de récolte et d’entretien des embryons de poisson-zèbre, avec les modifications décrites ci-dessous. Croisez une famille de poissons-zèbres à nageoires longues (TL) Tupfel de type sauvage ou de poissons-zèbres de la lignée transgénique sélectionnée (ici, Mpeg1 : Kaede) dans un réservoir avec un filet ajouté pour inciter les femelles adultes à produire des œufs après l’allumage de la lumière, puis séparez les adultes des œufs produits.
2. Le lendemain, collectez les embryons et jetez les non transparents, qui ne sont pas viables. Conservez environ 60 embryons par boîte de Pétri (100 mm de diamètre) dans le milieu E3 et incubez à 28 °C. Retirez les embryons morts et anormaux et rafraîchissez le milieu E3 quotidiennement.

3. Préparation des aiguilles d’injection

1. Préparez les aiguilles microcapillaires en verre pour l’injection à l’aide d’un instrument extracteur de micropipettes. Utilisez les réglages suivants : chaleur : 772, traction : 100, vel : 200, temps : 40, gaz : 75.
2. Cassez la pointe de l’aiguille à l’aide d’une pince à l’endroit où l’aiguille a un diamètre extérieur d’environ 20 m (pour les microsphères de 10 m), à l’aide d’un microscope optique muni d’une barre d’échelle dans l’oculaire. Évitez les aiguilles avec une très grande ouverture, car elles compromettront la survie des embryons.
   NOTE: L’ouverture peut être choisie pour être plus petite ou plus grande, en fonction de la taille et de la forme des biomatériaux à injecter. Dans la littérature, il a été rapporté que des injections à l’aide d’aiguilles avec une ouverture d’environ 50 μm entraînaient une diminution significative de la survie de l’embryon.

4. Injection de bactéries uniquement ou de microsphères bactériennes en suspension dans des embryons de poisson-zèbre

1. Chauffer une solution d’agarose (1 à 1,5 % (en poids) dans de l’eau demi-eau) à l’aide d’un four à micro-ondes et verser dans une boîte de Pétri de 100 mm. Placez un modèle de moule en plastique sur la solution d’agarose dans la boîte de Pétri pour créer des indentations dans l’agarose afin de placer les embryons dans des positions appropriées et de faciliter les injections. Incuber à température ambiante et retirer le moule lorsque la solution d’agarose s’est solidifiée.
2. À 3 jours après la fécondation, placez les embryons dans une boîte de Pétri de 100 mm contenant 0,02 % (p/v) d’acide 3-aminobenzoïque (tricaïne) pour les anesthésier. Après 5 min, transférez les embryons sur la plaque d’agarose recouverte d’un milieu E3 contenant 0,02 % (p/v) de tricaïne et alignez-les dans une orientation pour l’injection. Pour la lignée transgénique Mpeg1 : Kaede, anesthésie d’abord les embryons dans un milieu E3 contenant 0,02 % (p/v) de tricaïne. Ensuite, sélectionnez des embryons exprimant des protéines fluorescentes vertes à l’aide d’un microscope à stéréofluorescence.
3. Chargez l’aiguille avec environ 10 μL de suspension « Bactéries uniquement » ou Bactéries-Microsphères à l’aide d’une pointe de pipette à microchargeur. Montez l’aiguille sur un micromanipulateur relié au micro-injecteur. Pour l’injecteur utilisé ici (voir tableau des matériaux), utilisez les réglages suivants pour les injections de 2 à 3 nL : pression : 300 à 350, contre-pression : 0, temps : 2 ms. REMARQUE : Les paramètres du micro-injecteur dépendent de l’injecteur utilisé. Il peut être nécessaire d’ajuster les paramètres de l’injecteur pour les injections de bactéries mélangées à des biomatériaux de formes ou de tailles différentes.
   1. Utilisez des aiguilles avec la même ouverture pour l’injection de la suspension « Bactéries uniquement » et de la suspension Bactéries-Microsphères. Si l’aiguille est cassée ou bouchée, remplacez-la toujours par une nouvelle aiguille pour d’autres injections.
4. Insérez l’aiguille dans le tissu musculaire des embryons au microscope optique (Figure 1), à un angle de 45 à 60° entre l’aiguille et le corps des embryons. Ajustez la position de l’aiguille dans le tissu en la déplaçant doucement d’avant en arrière. Injectez les embryons à l’aide d’une pédale reliée au micro-injecteur.
5. Après l’injection de bactéries fluorescentes, notez les embryons pour une infection réussie à l’aide d’un microscope à stéréofluorescence. Jetez les embryons dont le score est négatif (pas de bactéries fluorescentes visibles ou pas de microsphères fluorescentes visibles). Conservez les embryons individuellement dans un milieu E3 dans des plaques de 48 puits. Rafraîchissez le support quotidiennement.

5. Broyage des embryons, marquage microscopique et culture quantitative des bactéries

1. Noter tous les embryons au microscope microscopique pour détecter la présence de bactéries fluorescentes à l’aide d’un microscope à stéréofluorescence, en commençant immédiatement après les injections, et chaque jour suivant jusqu’à ce que les embryons soient sélectionnés au hasard pour la culture quantitative.
2. Sélectionnez au hasard quelques embryons infectés vivants (5 à 6 dans la présente étude) peu de temps après l’injection et transférez-les individuellement dans des microtubes séparés de 2 mL à l’aide d’embouts stériles. Retirez le milieu, lavez une fois les embryons délicatement avec du PBS stérile et ajoutez 100 μL de PBS stérile.
3. Ajoutez 2 à 3 billes de zircone stériles (2 mm de diamètre) dans chaque flacon et écrasez les embryons à l’aide de l’homogénéisateur (voir le tableau des matériaux) à 3 500 tr/min pendant 30 s. Cultivez l’homogénat quantitativement comme décrit à l’étape 1.3.
   NOTE: D’autres homogénéisateurs peuvent nécessiter des réglages différents.
4. Sélectionner au hasard plusieurs embryons les jours suivants après l’injection pour une culture quantitative conformément à l’étape 5.3.

Résultats

Figure 1 : Procédure schématique de co-injection de suspension de bactéries-microsphères dans le muscle de la queue d’embryons de poisson-zèbre.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Gélose tryptique au soja	BD Difco	236950	Unité de préparation des médias chez AMC
Bouillon de soja tryptique	BD Difco	211825
Polyvinylpyrrolidone40	Applichem	N° A2259.0250
Microsphères de polystyrène de 10 μm de diamètre (bleu fluorescent)	Technologie du vivant/ThemoFisher	F8829
Microcapuliaire en verre (1 mm de diamètre extérieur x 0,78 mm de diamètre intérieur)	Appareil de Harvard	30-0038
Instrument d’extraction de micropipettes	Sutter Instrument Inc	Flaming p-97
Microscope optique LM 20	Leica	OMD33 10450123
Acide 3-aminobenzoïque (tricaïne)	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Agarose MP	Roche	11388991001
Microscope stéréo fluorescent LM80	Leica	MDG3610450126
Pointes de pipette à microchargeur	Eppendorf	5242956.003
Micromanipulateur M3301 avec support M10	Instruments de précision mondiaux	00-42-101-0000
Micro-injecteur FemtoJet express	Eppendorf	Référence 5248ZO100329
Microtrube 2ml pp	Sarstedt	72.693.005
Perles de zircone	Bio-connexion	Référence 11079124ZX
Lyser MagNA	Roche	41416401
Chloramphénicol	Sigma-Aldrich	Réf. C0378
Agitateur gyrotory (pour la croissance bactérienne)	Scientifique du Nouveau-Brunswick	G10
Incubateur de poisson-zèbre	VWR	Ligne Incu
Cuvettes	MARQUE	759015
Centrifugeuse	Hettich-Zentrifügen	ROTANTA 460R
Spectromètre	Pharmacia biotech	Ultrospec®2000
Forceps	Sigma-Aldrich	Référence F6521-1EA
48 plaques à puits	Greiner bio-one	677180
96 plaques à puits	Greiner bio-one	655161
Boîte de Petri	Faucon	353003
Boîte de Petri	Biomérieux	NL-132