Préparation d’un inoculum bactérien unicellulaire

1. Préparation d’inoculum unicellulaire de Mycobacterium marinum (figure 1)

1. Décongeler le stock de glycérol de Mycobacterium marinum fluorescent céruléen à partir de -80 °C et inoculer une plaque de gélose 7H10 avec 10 % (v/v) d’OADC (acide oléique, albumine, dextrose, catalase), 0,25 % de glycérol et 50 μg/mL d’hygromycine. Incuber la plaque à 32 °C pendant environ 10 jours.
2. Sélectionner une colonie exprimant une fluorescence positive et inoculer 3 mL de milieu 7H9 avec 10 % d’OADC, 0,5 % de glycérol et 50 μg/mL d’hygromycine.
   1. Incuber l’inoculation à 32 °C et à 100 tours par minute (tr/min) pendant 4 à 6 jours jusqu’à ce que la culture atteigne la phase logarithmique (DO₆₀₀ = 0,6 à 1,0).
   2. Sous-culture (1:100) dans 30 mL de milieu frais 7H9 avec 10 % d’OADC, 0,5 % de glycérol, 0,05 % de Tween-80 et 50 μg/mL jusqu’à ce que la DO₆₀₀ atteigne ~1,0.
      NOTE: À ce stade, une étape de sous-culture est recommandée pour une qualité de culture optimale. D’après notre expérience, l’ajout du clone directement à un grand volume de milieu entraînera la formation de touffes bactériennes.
3. Prélever des cellules de M. marinum comme décrit ci-dessous.
   1. Centrifuger à 3 000 x g pendant 10 min pour recueillir le M. marinum sous forme de pastille. Jetez tout le surnageant sauf 300 μL et utilisez-le pour remettre le plomb en suspension.
   2. Ajouter 3 mL de milieu 7H9 avec 10 % de glycérol pour remettre la pastille en suspension, puis soniser la suspension dans un bain-marie à 100 W à 15 s ON, 15 s OFF pour un total de 2 min.
      NOTE: La sonication est utilisée pour obtenir un homogénat unicellulaire pour l’inoculum, ce qui empêche l’aiguille de micro-injection d’être bloquée.
4. Transférez la suspension bactérienne dans une seringue de 10 ml et passez-la à travers un filtre de 5 μm pour éliminer les grumeaux.
5. Mesurez la densité optique (DO) de la suspension à l’aide d’un spectrophotomètre et diluez-la à_{OD 600} = 1,0 avec un milieu 7H9 contenant 10 % de glycérol. Divisez la suspension en aliquotes de 10 μL et conservez-la au congélateur à -80 °C pour une utilisation future.
6. Confirmer la concentration bactérienne de l’inoculum (ufc/mL) par dilution et ensemencement en série du stock bactérien sur une plaque de gélose 7H10 contenant 10 % (v/v) d’OADC, 0,5 % de glycérol et 50 μg/mL d’hygromycine.

Figure 1 : Schéma de principe de la préparation de bactéries unicellulaires. Des stocks unicellulaires de Mycobacterium marinum à fluorescence céruléenne ont été générés en suivant le processus décrit.