Préparation d’un inoculum bactérien unicellulaire

Dans cet article

Résumé

Source : Niu, L., et al., Visualisation de la mort des cellules lytiques des macrophages au cours d’une infection mycobactérienne chez des embryons de poisson-zèbre via la microscopie intravitale. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre la préparation d’une suspension unicellulaire de Mycobacterium marinum à partir d’une culture en phase logarithmique tardive pour une utilisation cohérente dans les tests d’infection et les applications en aval.

Protocole

1. Préparation d’inoculum unicellulaire de Mycobacterium marinum (figure 1)

Décongeler le stock de glycérol de Mycobacterium marinum fluorescent céruléen à partir de -80 °C et inoculer une plaque de gélose 7H10 avec 10 % (v/v) d’OADC (acide oléique, albumine, dextrose, catalase), 0,25 % de glycérol et 50 μg/mL d’hygromycine. Incuber la plaque à 32 °C pendant environ 10 jours.
Sélectionner une colonie exprimant une fluorescence positive et inoculer 3 mL de milieu 7H9 avec 10 % d’OADC, 0,5 % de glycérol et 50 μg/mL d’hygromycine.
1. Incuber l’inoculation à 32 °C et à 100 tours par minute (tr/min) pendant 4 à 6 jours jusqu’à ce que la culture atteigne la phase logarithmique (DO₆₀₀ = 0,6 à 1,0).
2. Sous-culture (1:100) dans 30 mL de milieu frais 7H9 avec 10 % d’OADC, 0,5 % de glycérol, 0,05 % de Tween-80 et 50 μg/mL jusqu’à ce que la DO₆₀₀ atteigne ~1,0.
  NOTE: À ce stade, une étape de sous-culture est recommandée pour une qualité de culture optimale. D’après notre expérience, l’ajout du clone directement à un grand volume de milieu entraînera la formation de touffes bactériennes.
Prélever des cellules de M. marinum comme décrit ci-dessous.
1. Centrifuger à 3 000 x g pendant 10 min pour recueillir le M. marinum sous forme de pastille. Jetez tout le surnageant sauf 300 μL et utilisez-le pour remettre le plomb en suspension.
2. Ajouter 3 mL de milieu 7H9 avec 10 % de glycérol pour remettre la pastille en suspension, puis soniser la suspension dans un bain-marie à 100 W à 15 s ON, 15 s OFF pour un total de 2 min.
  NOTE: La sonication est utilisée pour obtenir un homogénat unicellulaire pour l’inoculum, ce qui empêche l’aiguille de micro-injection d’être bloquée.
Transférez la suspension bactérienne dans une seringue de 10 ml et passez-la à travers un filtre de 5 μm pour éliminer les grumeaux.
Mesurez la densité optique (DO) de la suspension à l’aide d’un spectrophotomètre et diluez-la à_{OD 600} = 1,0 avec un milieu 7H9 contenant 10 % de glycérol. Divisez la suspension en aliquotes de 10 μL et conservez-la au congélateur à -80 °C pour une utilisation future.
Confirmer la concentration bactérienne de l’inoculum (ufc/mL) par dilution et ensemencement en série du stock bactérien sur une plaque de gélose 7H10 contenant 10 % (v/v) d’OADC, 0,5 % de glycérol et 50 μg/mL d’hygromycine.

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Résultats

Figure 1 : Schéma de principe de la préparation de bactéries unicellulaires. Des stocks unicellulaires de Mycobacterium marinum à fluorescence céruléenne ont été générés en suivant le processus décrit.