Obtention d’amyloïdes cytotoxiques à la suite d’une infection bactérienne de cellules endothéliales pulmonaires de rat

Dans cet article

Résumé

Source : Balczon, R., et al. Méthodes de détection des amyloïdes cytotoxiques à la suite de l’infection de cellules endothéliales pulmonaires par Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo montre la procédure de génération d’un surnageant cytotoxique à partir de cellules endothéliales pulmonaires après une infection par Pseudomonas aeruginosa. Il décrit comment les protéines effectrices bactériennes perturbent la structure de la cellule hôte et induisent la libération d’oligomères amyloïdes cytotoxiques dans le surnageant.

Protocole

Génération de surnageants cytotoxiques :

Des cultures primaires de cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires (PMVEC) de rat ont été obtenues à partir de la plateforme de culture cellulaire du Centre de biologie pulmonaire de l’Université de l’Alabama du Sud.

Pour la génération de surnageants cytotoxiques, déposer 2 x 10⁶ cellules dans des boîtes individuelles de 150 cm et les faire croître pendant 3 à 4 jours jusqu’à ce que la confluence soit atteinte. Utilisez deux plaques par expérience.
Pour produire du surnageant, lavez l’une des deux boîtes de 150 cm de PMVEC avec une solution saline tamponnée au phosphate, trypsinisant, puis comptez les cellules. Lavez l’autre plat de PMVEC avec la solution saline équilibrée de Hank (HBSS), puis infectez-le avec l’une ou l’autre souche de Pseudomonas aeruginosa à une multiplicité d’infection (MOI) de 20:1. Pour ce faire, procédez comme suit :
1. Pour P. aeruginosa, DO₅₄₀ 0,25 = 2 x 10⁸ UFC/mL. Pour préparer cette dilution, ajoutez 1 mL de HBSS dans une cuvette jetable de 1 mL. Grattez suffisamment de bactéries de la plaque jusqu’à ce qu’une OD₅₄₀ de 0,25 soit mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre. L’étape suivante fournira un calcul de la quantité de bactéries qui sera nécessaire.
2. Une fois que le nombre de CEVEA dans la boîte de culture est déterminé, déterminez le nombre approprié de bactéries à ajouter à la deuxième boîte de culture non trypsinisée contenant les CEVE. Par exemple, s’il est déterminé que la boîte de culture des CEPVEC contient 1,3 x 10⁷ cellules, préparez 1,3 x 10⁷ cellules x 20 bactéries/cellule x 1 mL/2 x 10⁸ UFC = 1,3 mL de bactéries.
3. Diluez les 1,3 mL de bactéries dans le HBSS jusqu’à ce qu’ils atteignent un volume final de 20 mL, de sorte que toute la surface d’un plat de 150 cm puisse être recouverte de liquide, puis ajoutez les bactéries diluées dans la plaque de PMVEC.
4. Incuber les PMVEC inoculés avec la bactérie à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂pendant 4 à 5 h, jusqu’à ce que l’on puisse voir des espaces se former dans la monocouche cellulaire lorsque la plaque est observée au microscope (voir la figure 1 pour le niveau approprié de formation d’espaces).
5. Récupérez le surnageant, puis centrifugez-le pendant 10 minutes à 2 000 x g dans une centrifugeuse de table pour éliminer les débris cellulaires.
  Note: N’importe quelle centrifugeuse de table capable de générer une force g suffisante pour granuler les cellules non lysées et les gros fragments de cellules peut être utilisée pour cette étape.
6. Versez le surnageant dans une seringue munie d’un filtre de 0,2 μm à son extrémité, puis passez le surnageant à travers le filtre pour éliminer les bactéries.
7. Utilisez une aliquote du surnageant stérile pour tester la cytotoxicité et congelez le reste du surnageant à -80 °C pour une utilisation future.

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Résultats

Graphique 1. Effets de l’inoculation de P. aeruginosa sur la morphologie du PMVEC. Une monocouche confluente de PMVEC avant (A) et quatre heures après l’ajout (B) de la souche PA103 de P. aeruginosa. Des lacunes sont clairement vi...