Suivi de la dynamique d’infection bactérienne chez une souris à l’aide de la bioluminescence

Résumé

Source : Valentine, M. E., et al. Génération de mutants de délétion de gène dans le cadre chez Pseudomonas aeruginosa et test d’atténuation de la virulence dans un modèle murin simple d’infection. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo démontre l’utilisation de la bioluminescence pour visualiser et comparer le comportement in vivo de souches bactériennes virulentes et atténuées chez la souris. Il décrit la préparation de suspensions bactériennes bioluminescentes et leur injection intrapéritonéale chez la souris. La souche virulente présente une propagation systémique, tandis que la souche atténuée reste localisée et disparaît progressivement, comme l’indique le signal d’évanouissement.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Inoculation d’animaux avec des souches bactériennes par injection
   1. Le matin des injections, retirer les cryoflacons des souches bactériennes testées et décongeler à 4 °C pendant 3-4 h. Décongeler 0,5 mL pour chaque souris qui sera injectée. Conservez les flacons sur de la glace après la décongélation et injectez les souris dans les 2 heures.
   2. Après la décongélation, transférez chaque flacon cryogénique dans un nouveau tube de 2 mL et centrifugez-le à 4 500 x g pendant 10 min, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate 1 oz.
   3. Centrifuger à nouveau à 4 500 x g pendant 10 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 1x PBS jusqu’à une concentration finale de 2,5 x 10⁹ UFC/mL (UFC : unités formant colonies). La quantité exacte de 1x PBS utilisée variera légèrement d’une souche à l’autre.
      1. Prélever 3 échantillons de la suspension finale de chaque souche pour valider l’UFC/mL, le génotype et le phénotype, comme décrit ci-dessus.
   4. Pour chaque souche, aliquote 1,5 mL de suspension PBS/cellulaire dans un tube de 2 mL par 5 souris afin de limiter le nombre de fois où le tube est pénétré. Préparez également des tubes de 1x PBS pour les injections de contrôle.
   5. Rassemblez des souris (10 mâles et 10 femelles C57BL/6 par groupe pour cette expérience) et le matériel nécessaire aux injections (seringues, aiguilles, contenants pour objets tranchants, marqueurs, stylo et papier, etc.). Passez à la salle d’opération des animaux stériles. Essuyez toutes les surfaces avec des lingettes désinfectantes.
      1. Pour éliminer la détresse et le risque de blessure pour l’expérimentateur, n’amenez qu’un seul sexe et un seul groupe expérimental de souris à la fois dans la salle d’opération (par exemple, un groupe de 10 souris mâles à infecter avec une souche particulière). Portez deux paires de gants en latex pour éviter la perforation des gants en cas de morsure. Portez une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité et un masque facial pour éviter toute contamination.
   6. Commencer les injections du groupe témoin avec 1x PBS. Cela permettra de déterminer si des effets indésirables résultent de l’injection seule.
      1. Retirez une souris de la cage. Ne retirez qu’une souris à la fois.
      2. Pesez la souris et marquez sa queue avec un marqueur permanent pour suivre la perte de poids après l’injection.
      3. Ouvrez une nouvelle seringue de 1 ml et une aiguille de 27 g (utilisez une nouvelle seringue et une aiguille pour chaque souris afin d’éliminer la contamination) et injectez 200 μL de PBS 1x stérile.
         1. Saisissez la souris derrière ses oreilles à l’aide du pouce et de l’index. Pincez pour créer un pli cutané au niveau de la nuque à tenir - un pli plus serré réduit les mouvements du cou et le risque d’être mordu pendant l’injection. Fixez la queue dans la paume à l’aide du petit doigt pour maintenir la souris à plat avec peu de mouvement.
         2. Retournez la souris et insérez l’aiguille à un angle de 30° dans la cavité péritonéale à gauche ou à droite de la ligne médiane. Soulevez légèrement l’aiguille une fois insérée pour vous assurer qu’elle a été insérée dans la région intrapéritonéale et non dans les organes. Injectez lentement le PBS, puis retirez l’aiguille.
         3. Placez l’aiguille usagée dans un contenant désigné pour les objets tranchants et présentant un risque biologique. Ne réutilisez pas la seringue ou l’aiguille. Un bolus au site d’injection est typique.
      4. Après l’injection, déplacez la souris dans une cage séparée.
      5. Répétez la procédure avec la souris suivante. Une fois que toutes les souris d’une cage ont été injectées, remettez-les immédiatement dans leur cage d’origine.
   7. Après avoir injecté le groupe témoin, commencer à injecter les suspensions des souches à tester en suivant la même procédure.
      1. Injecter 200 μL de suspension cellulaire. Lorsqu’on commence avec des suspensions cellulaires de 2,5 x 10⁹ UFC/mL, chaque souris reçoit 5 x 10⁸ UFC.
         NOTE: Ces concentrations ont été optimisées à l’aide de recherches préliminaires sur des animaux afin de déterminer les doses létales de chaque souche. Il peut être nécessaire d’ajuster la posologie pour d’autres souches/espèces.
   8. Une fois toutes les injections terminées, retournez les souris dans la salle d’hébergement pour soulager la détresse. Nettoyez l’espace de travail avec des lingettes désinfectantes.
   9. Surveiller la mortalité des animaux après l’injection en vérifiant les cages pour les souris mortes toutes les 3 h pendant 72 h et toutes les 12 h pendant 10 jours. Enregistrez le poids des souris toutes les 12 heures pour déterminer la perte de poids due à la maladie.

Matériaux