Génération de recombinants à double croisement de Pseudomonas aeruginosa pour la délétion ciblée de gènes

Résumé

Source : Valentine, M. E., et al. Génération de mutants de délétion de gène dans le cadre chez Pseudomonas aeruginosa et test d’atténuation de la virulence dans un modèle murin simple d’infection. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo démontre la génération de recombinants à double croisement chez Pseudomonas aeruginosa à l’aide d’une stratégie de délétion de gènes basée sur un plasmide. Le processus consiste à sélectionner des bactéries qui hébergent un plasmide non réplicatif intégré dans le génome via un seul croisement, puis à induire un deuxième événement de recombinaison sous sélection de saccharose pour exciser le plasmide. La réussite de la recombinaison à double croisement est confirmée par la perte de résistance aux antibiotiques et la capacité de se développer sur des milieux contenant du saccharose.

Protocole

1. Détection des recombinants à double croisement de P. aeruginosa

1. Pour chaque culture en bouillon, inoculer 10 μL de culture sur une plaque préchauffée de PIA (Pseudomonas Isolation Agar) complétée par 10 % de saccharose (sans glycérol) et de stries pour les colonies isolées. Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C.
2. Le lendemain, retirez les plaques de l’incubateur et inspectez-les pour leur croissance. Les colonies résistantes au saccharose doivent être des recombinants à double croisement (c’est-à-dire qu’elles ont retiré le plasmide du chromosome par un événement de recombinaison entre l’autre région homologue de l’insert plasmidique et le chromosome de P. aeruginosa ).
   1. Étalez au moins 20 colonies avec des cure-dents stériles sur des plaques préchauffées de : 1) PIA, 2) PIA complété avec 10 % de saccharose (sans glycérol) et 3) PIA complété avec 300 μg/mL de carbénicline.
3. Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C.
4. Retirez les plaques de l’incubateur et examinez-les pour voir si elles poussent. Les véritables recombinants à double croisement seront sensibles à la carbénicilline et résistants au saccharose (c.-à-d. les colonies qui ont grandi avec du PIA et du PIA supplémenté en saccharose, mais qui n’ont pas poussé avec du PIA supplémenté avec de la carbénicilline).

Matériaux