Préparation et isolement de spores de Streptomyces venezuelae à partir d’une culture liquide

Résumé

Source : Schlimpert, S., et al. Imagerie par fluorescence du cycle de vie complet de S. venezuelae à l’aide d’un dispositif microfluidique. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo montre la culture et l’isolement des spores de Streptomyces venezuelae. Les spores, cellules dormantes qui aident les bactéries à survivre au stress, sont produites lors de la limitation des nutriments et collectées par centrifugation. La méthode garantit une suspension de spores pures et stockées au froid pour les applications en aval.

Protocole

1. Isolement des spores fraîches de Streptomyces venezuelae et préparation du milieu de culture épuisé

1. Inoculer 30 ml de milieu d’extrait de maltose-extrait de malt (MYM), complété par une solution d’oligo-éléments R2 de 60 μl, avec 10 spores de souche SV60 [attBφBT1 ::p SS209 (PdivIVA-divIVA-mcherry PftsZ-ftsZ-ypet)]. Pour une croissance et une sporulation constantes des cellules, utilisez un flacon à chicanes ou un ballon contenant un ressort pour permettre une aération suffisante.
2. Cellules de culture pendant 35 à 40 heures à 30 °C et 250 tr/min.
3. Examiner les cellules par microscopie à contraste de phase montée sur liquide. À ce stade, les fragments de mycélium et les spores seront visibles.
4. Centrifuger 1 ml de cellules dans une centrifugeuse de table à 400 x g pendant 1 min pour granuler le mycélium et les fragments cellulaires plus gros.
5. Transvasez environ 300 μl de surnageant contenant une suspension de spores dans un tube neuf de 1,5 ml et conservez-le sur de la glace. Conservez le milieu de culture restant
6. Diluer les spores à 1:20 dans MYM-TE (concentration finale : 0,5-5 x 10⁷ spores/ml) et les conserver sur de la glace jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
   REMARQUE : Bien que l’on ne comprenne pas les conditions exactes qui déclenchent la sporulation chez Streptomyces , l’utilisation d’un milieu MYM-TE usé, y compris tout signal extracellulaire inconnu provenant d’une culture sporulante, stimule la sporulation.
7. Stériliser par filtration 10 ml du milieu de culture restant pour obtenir du MYM-TE épuisé exempt de spores et de fragments de mycélium. À l’aide d’un filtre à seringue stérile de 0,22 μm, transférez le MYM-TE usagé dans un tube stérile de 15 ml.
8. Conservez le MYM-TE épuisé préparé pendant quelques jours à 4 °C si des expériences supplémentaires dans des conditions de croissance similaires doivent être menées.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Extrait de malt (MYM)4 g de maltose4 g d’extrait de levure10 g d’extrait de malt, ajoutez 1 L H2O avec 50 % d’eau du robinet et 50 % d’eau d’osmose inverse et complétez avec 200 ml de solution d’oligo-éléments R2 pour 100 ml après autoclave			Milieu de sporulation utilisé pour la culture de Streptomyces venezuelae SV60
R2 Solution d’oligo-éléments (TE)8 mg ZnCl240 mg FeCl 3-6H 2O2 mg CuCl2-2H 2O2 mg MnCl2-4H 2O2 mg Na2B4O7-10H 2O2 mg (NH4)6Mo7O24-4H 2Oadd 200 ml H2OAutoclave et conserver à 4 °C			Ajouter 0,002 volumes à MYM
PBS (solution saline tamponnée au phosphate)	Sigma	P4417-100TAB	Utilisé pour remplir les puits d’entrée des voies inutilisées dans les plaques B04A afin de préparer les plaques pour le stockage à court terme.
Filtres à seringue de 0,22 μm	Satorius stedim	Référence 16532-K	Préparation des MYM-TE usagés