Imagerie par fluorescence du cycle de vie de Streptomyces venezuelae

Résumé

Source : Schlimpert, S. et al. Imagerie en accéléré de fluorescence du cycle de vie complet de S. venezuelae à l’aide d’un dispositif microfluidique. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo fait une démonstration d’imagerie en fluorescence du cycle de vie complet de la bactérie Streptomyces venezuelae à l’aide d’un dispositif microfluidique pour visualiser la germination, la croissance des hyphes et la sporulation en temps réel.

Protocole

1. Configuration du microscope et du protocole time-lapse

Note: Cette méthode a été mise en œuvre sur un microscope à champ large inversé entièrement motorisé et automatisé équipé d’une caméra sCMOS, d’une lampe aux halogénures métalliques, d’un autofocus matériel, d’un support de platine pour plaques à 96 puits et d’une chambre environnementale.

1. Préchauffez la chambre environnementale à 30 °C à l’avance afin d’éviter les problèmes avec l’autofocus après le début de l’expérience. Le temps nécessaire dépend de la chambre environnementale utilisée, du microscope et du système de chauffage. Commencez à chauffer le système la veille de l’expérience.
2. Allumez le microscope et le logiciel d’automatisation et de contrôle de la microscopie. Utilisez un objectif à immersion dans l’huile à grande ouverture numérique (NA) pour une collecte de signal et une résolution spatiale optimales, tel qu’un objectif DIC à huile 100X, 1,46 NA. Sélectionnez les filtres et les miroirs dichromatiques appropriés pour acquérir des images à contraste interférentiel différentiel (CID) et des images de fusions de protéines jaune-fluorescente et rouge-fluorescente.
3. Placez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif et ajoutez du liquide d’immersion au bas de la fenêtre d’imagerie sur la plaque microfluidique pour améliorer la mise au point de la cellule lors de l’acquisition de l’image. Montez avec précaution le dispositif microfluidique scellé sur la platine du microscope inversé. Assurez-vous que la plaque est bien placée dans le support de platine et qu’elle ne se déplace pas au cours de l’expérience.
4. Faites la mise au point de la fenêtre d’imagerie de la chambre de culture microfluidique à l’aide des marqueurs de position intégrés pour l’orientation. Concentrez-vous sur la partie la plus à gauche de la première chambre d’écoulement (étiquetée « A ») avec la taille du piège 5, correspondant à une hauteur de piège de 0,7 μm.
5. Dans le logiciel de microfluidique, les cellules de charge du puits d’entrée 8 à 4 psi pendant 15 sec. Vérifiez la densité cellulaire dans la chambre de culture en déplaçant la platine sur la fenêtre d’imagerie. Si aucune spores n’a été piégée, répétez l’étape de chargement cellulaire ou augmentez la pression et/ou le temps de chargement jusqu’à ce que la densité cellulaire souhaitée soit atteinte (1 à 10 spores par fenêtre d’imagerie avec 2 048 x 2 048 pixels). Évitez de surcharger la chambre de culture. Note: Nous utilisons normalement la taille de piège 5 pour l’imagerie des Streptomyces, mais nous avons également obtenu de bons résultats avec des pièges de tailles 4 et 3.
6. Démarrez le programme de flux dans le logiciel de contrôle et laissez la plaque microfluidique s’équilibrer thermiquement pendant 1 heure dans la platine du microscope avant de commencer l’acquisition de l’image.
7. Dans le logiciel de contrôle du microscope, configurez une acquisition multidimensionnelle pour prendre plusieurs images à plusieurs positions de platine au fil du temps :
   1. Pour l’enregistrement automatique : spécifiez un répertoire pour l’enregistrement automatique des fichiers image.
   2. Pour les paramètres d’éclairage, déterminez à l’avance les paramètres d’éclairage optimaux pour chaque construction spécifique. Pour l’expérience décrite, utilisez les temps d’exposition suivants : DIC 150 msec, YFP 250 msec, RFP 100 msec.
   3. Pour les séries chronologiques : configurez une série chronologique pour acquérir des images aux points temporels souhaités dans l’ordre. Pour imager le cycle de vie de S. venezuelae, sélectionnez un intervalle de temps de 40 minutes sur une période de 24 heures.
   4. Pour les positions de platine et l’autofocus : scannez la chambre de culture en déplaçant la platine et enregistrez les positions de platine pour chaque position d’imagerie d’intérêt. Assurez-vous que les positions à un étage sont suffisamment éloignées pour minimiser le photoblanchiment et la phototoxicité. En règle générale, utilisez jusqu’à 12 positions. Exécutez la routine de mise au point automatique pour chaque point temporel afin de corriger la dérive focale lente. Si elle est disponible dans le logiciel de contrôle du microscope, réglez la stratégie de mise au point automatique sur « Mise à jour de la surface locale par autofocus matériel ». Une fois que les coordonnées Z des positions de platine sélectionnées sont vérifiées, activez l’autofocus matériel.
8. Démarrez l’expérience en accéléré dans le logiciel de contrôle du microscope.
9. Vérifiez que toutes les positions de la scène sont toujours nettes à des moments ultérieurs. Pour les expériences en accéléré qui durent plusieurs heures, nous observons parfois une dérive de la scène, même en utilisant l’autofocus. Si les positions de la platine doivent être refocalisées, arrêtez l’expérience à un moment approprié, ajustez la mise au point et redémarrez l’expérience dans l’intervalle de temps d’imagerie défini.
10. Arrêter l’acquisition d’images après 24 à 30 heures ou lorsque les hyphes de la région d’intérêt se sont différenciés en spores. Ensuite, arrêtez le programme de flux dans le logiciel et démontez le dispositif microfluidique.
11. Préparez la plaque microfluidique usagée pour un stockage à court terme. Retirez le reste du milieu des puits 1 à 6, videz le puits de déchets 7 et le puits de chargement de la cellule 8. Dans des conditions stériles, remplissez à nouveau les puits usagés de la voie « A » et les puits des voies inutilisées (« B » à « D ») sur la plaque avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS). Fermez la plaque avec du parafilm pour éviter qu’elle ne se dessèche et conservez-la à 4 °C.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
B04A Plaque CellAsic ONIX pour cellules bactériennes	Merck-Millipore	B04A-03-5PK	Plaques de culture microfluidiques
Système de perfusion microfluidique CellAsic ONIX et ONIX FG (version 5.0.2)	Merck-Millipore	EV-262	La dernière version d’ONIX (juillet 2015) et les instructions d’utilisation du programme sont disponibles ici : http://www.merckmillipore.com
Axio Observer.Z1 Microscope	Zeiss	431007-9902-000	Microscope inversé à grand champ entièrement automatisé et motorisé
Incubateur XL multi S1 avec module de température S1 et unité de chauffage XL S2	Zeiss	411857-9061-000	Chambre environnementale entourant le microscope
Plan-Apochromat 100x/1.46 Objectif DIC à l’huile	Zeiss	420792-9800-000
Ocra FLASH 4 V2	Hamamatsu Photonics K.K.	Réf. C11440-22CU
Illuminateur HXP 120V	Zeiss	423013-9010-000
FL Set de filtres 46 HE YFP sans décalage	Zeiss	489046-9901-000	Jeu de filtres fluorescents, excitation 500/25 nm, émission 535/30 nm
FL Set de filtres 63 HE RFP sans décalage	Zeiss	489063-0000-000	Jeu de filtres fluorescents, excitation 572/25 nm, émission 629/30 nm
Châssis de montage K-M pour plaques multipuits	Zeiss	000000-1272-644	Support de platine pour plaque microfluidique
ZEN pro 2012	Zeiss	410135-1002-120	Logiciel de contrôle de microscope
ZEN Module Time Lapse	Zeiss	410136-1031-110	Module logiciel pour la mise en place d’expériences de microscopie time-lapse
Tuiles/Positions du module ZEN	Zeiss	410136-1025-110	Module logiciel pour enregistrer des positions de scène spécifiques (xzy)
Fidji	progiciel open source	http://fiji.sc/Fiji	Génération de vidéos time-lapse
PBS (solution saline tamponnée au phosphate)	Sigma	P4417-100TAB	Utilisé pour remplir les puits d’entrée des voies inutilisées dans les plaques B04A afin de préparer les plaques pour le stockage à court terme.
SV60	Collection de souches du John Innes Centre		Souche S. venezuelae exprimant divIVA-mcherry et ftsZ-ypet