Comportement d’essaimage de Pseudomonas aeruginosa sous stress antibiotique

Résumé

Source : Bru, J., et al., Imagerie en accéléré des essaims bactériens et de la réponse collective au stress. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo montre la procédure d’analyse du comportement d’essaimage de Pseudomonas aeruginosa en observant la croissance bactérienne d’une culture centrale vers des points satellites contenant la même culture mélangée à un antibiotique, à l’aide d’une configuration de plaque de gélose et d’une imagerie en accéléré.

Protocole

1. Croissance de P. aeruginosa et conditions d’ensemencement

1. Préparez 400 ml de bouillon de lysogénie (LB) en ajoutant 10 g de mélange de poudre LB-Miller à 400 ml de ddH₂O. Ajoutez 8 g supplémentaires de gélose pour les boîtes de Pétri à 2 % de gélose LB. Autoclave pour stériliser.
2. Versez 20 ml de milieu fauteur LB-agar fondu dans des boîtes de Pétri de 10 cm de diamètre et laissez-les se solidifier à température ambiante pendant la nuit. Conservez le milieu liquide à température ambiante et les plaques de gélose à 4 °C.
3. Étalez P. aeruginosa sur une boîte de Pétri LB-agar à partir d’un bouillon congelé conservé à -80 °C à l’aide de boucles stériles ou de bâtonnets en bois. Incuber la boîte de Pétri à l’envers pendant la nuit à 37 °C. Conservez la plaque de gélose LB à 4 °C jusqu’à 1 semaine.
4. Prélevez une seule colonie dans la boîte de Pétri à l’aide d’une boucle stérile ou d’un bâtonnet en bois, inocunez-la dans un milieu de 2 ml de LB et incubez la culture jusqu’à saturation pendant la nuit (16 à 18 h) à 37 °C dans un rouleau à rouleaux réglé à 100 tr/min.
5. Pipeter 5 μL de culture de nuit à partir de l’étape 1.4 à l’aide d’une pipette P20 et repérer au centre de la plaque de gélose en s’approchant de la pointe de la pipette à un angle (10-45°) de 2,5 cm au-dessus de la zone de tache, en pipetant jusqu’à la première butée et en touchant la gélose avec seulement la goutte de liquide (Figure 1B).
   1. Évitez de toucher la gélose avec la pointe de la pipette, car cela pourrait endommager la gélose. Utilisez un gabarit pour positionner la tache de manière cohérente sur les différentes plaques de gélose en essaim.
6. Pour les traitements antibiotiques, mélanger 30 μL de culture de nuit de P. aeruginosa de l’étape 1.4 avec 6 μL de gentamycine à 3 mg/mL, 10 μL de kanamycine à 100 mg/mL ou 7,5 μL de fosfomycine à 100 mg/mL. Passez immédiatement à l’étape suivante.
   1. Pipeter 6 μL de P. aeruginosa traité aux antibiotiques à l’aide d’une pipette P20 et spot à 6 positions satellites équidistantes sur un cercle concentrique de 2,8 cm de rayon autour du centre de la boîte en approchant la pointe de la pipette à un angle (10 à 45°) de 2,5 cm au-dessus de la zone de repérage, en pipetant jusqu’au premier arrêt, et en touchant la gélose avec seulement la goutte de liquide (figure 1D).
   2. Évitez de toucher la gélose avec la pointe de la pipette, car cela pourrait l’endommager. Utilisez un gabarit de placage pour plus de cohérence.
7. Remplacez les couvercles transparents de la boîte de Pétri par des couvercles noirs (Figure 2A).
8. Placez les plaques de gélose d’essaimage sur un scanner dans un incubateur réglé à 37 °C avec un bain-marie de 10 L pour maintenir un taux d’humidité de 75 % (figure 1E, figure 2B). PRUDENCE: Ne dérangez pas les cellules tachetées sur les plaques de gélose en essaim. Gardez les assiettes vers le haut en tout temps.

Résultats

Figure 1 : Schéma de l’essai d’essaimage de P. aeruginosa et de la réponse collective au stress. (A) Les cellules de P. aeruginosa sont cultivées pendant la nuit (de 16 à 18 ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactifs
Agar-agar-Bacto, déshydraté	BD Difco	214010	Pour plaque de gélose LB et plaque de gélose d’essaimage
Acides aminés	BD Difco	223050	Pour les milieux d’essaimage
D-Glucose	Fisher Chemical	Réf. D16500	Dextrose. Pour les milieux d’essaimage
Sel disodique de fosfomycine	Industrie chimique de Tokyo	F0889	Concentration du stock : 200 mg/mL. Dissous dans ddH₂O
Sulfate de gentamycine	Sigma-Aldrich	G1914	Concentration de la pâte : 3 mg/mL. Dissous dans ddH₂O
Sulfate de kanamycine	Sigma-Aldrich	60615	Concentration de la matière : 100 mg/mL. Dissous dans ddH₂O
LB-Miller	BD Difco	244620	Pour les plaques de bouillon LB et de gélose LB
Sulfate de magnésium heptahydraté	Sigma-Aldrich	230391	Pour les milieux d’essaimage
Souches
Pseudomonas aeruginosa	Siryaporn lab	AFS27E.118	Souche PA14
Ravitaillement
Papier de verre en oxyde d’aluminium	3M	150 Amende	Pour couvercles noirs
Tissu noir	Joann	PRD7089	Tissu noir
Peinture en aérosol noire	Krylon	5592 Noir mat	Pour couvercles noirs
Erlenmeyer	Kimax	26500	250 ml
Bouteilles de conservation en verre	Pyrex	13951L	250 ml, 500 ml, 1000 ml
Attaches zippées de 8 pouces	Gardner Bender	E173770	Pour la fixation d’un tissu noir mat
Boîtes de Pétri (100 mm x 15 mm)	Pêcheur	FB0875712	Plaques de polystyrène de 100 x 15 mm
Bâtons en bois	Pêcheur	23-400-102	Pour le stries et l’inoculation de bactéries
Équipement
Autoclave	Forge du marché Industries	STM-E	Pour les réactifs de stérilisation
Pipette de 25 mL	États-Unis Scientific, Inc.	1072-5410	Pour pipeter 20 mL pour les plaques d’essaimage
Déshumidificateur	Frigidaire	FAD704DWD 70 pintes	Pour maintenir l’humidité relative de la pièce à environ 45 %
Incubateur	VWR	89032-092	Pour la croissance des bactéries à 37 °C
Bain-marie Isotemp	Pêcheur	15-462-21Q	Pour refroidissement des fluides jusqu’à 55 °C
Hotte à flux laminaire	La Baker Company	SG603A	Pour le séchage des plaques
Pipette P-20	Gilson	F123601	Taches sur les plaques de gélose en essaimage
Contrôleur de pipette	BrandTech	accu-jet	Pour pipeter 20 mL pour les plaques d’essaimage