Induction de la différenciation de Vibrio parahaemolyticus en cellules d’essaim

Résumé

Source : Heering, J., et al. Induction de la différenciation cellulaire et imagerie unicellulaire des cellules nageuses et de l’essaim de Vibrio parahaemolyticus . J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo montre l’induction de la différenciation des cellules d’essaim chez Vibrio parahaemolyticus à l’aide d’un milieu gélosé spécialement préparé. En manipulant les signaux environnementaux tels que l’épuisement en fer, la supplémentation en calcium et le contact de surface, les bactéries sont stimulées pour passer de leur forme nageuse à des cellules d’essaim allongées avec des flagelles latéraux. Ces cellules différenciées se propagent sur la surface solide, formant des éclairs d’essaim caractéristiques qui signifient un changement morphologique réussi.

Protocole

1. Induction de la différenciation des cellules de l’essaim

NOTE: Les étapes suivantes décrivent comment induire la différenciation de V. parahaemolyticus dans son cycle de vie cellulaire d’essaim et comment stimuler la prolifération sur des surfaces solides.

1. Suspendre 4 g de gélose à perfusion cardiaque (HI) dans 100 mL de jjdH₂O afin de préparer les plaques d’essaimage.

2. Faites bouillir soigneusement la solution de gélose HI au micro-ondes et secouez le flacon de temps en temps jusqu’à ce que la poudre soit dissoute. Autoclave à 121 °C pendant 20 min.

3. Après l’autoclavage, refroidir la gélose HI à 60-65 °C. Ajouter le 2,2'-Bipyridyle à une concentration finale de 50 μM (solution mère de 50 mM dans de l’éthanol à 100 %). Ajouter du CaCl₂ à une concentration finale de 4 mM (solution mère de 4 M dans jj₂O). Si nécessaire, ajoutez des antibiotiques dans la solution pour maintenir les plasmides.

NOTE: Si vous prévoyez d’utiliser un plasmide inductible, ajoutez un agent inducteur à sa concentration finale.

ATTENTION : 2,2'-Bipyridyle : Toxicité aiguë (orale, cutanée, inhalation). Utilisez des gants et des lunettes de sécurité lorsque vous manipulez ce produit chimique.

4. Versez 30 à 35 ml de la solution finale de gélose HI dans une boîte de Pétri ronde de 150 mm et laissez la gélose se solidifier.

5. Juste avant de repérer la culture cellulaire, faites sécher la plaque de gélose à 37 °C pendant au moins 10 minutes (ou jusqu’à ce que les résidus liquides aient disparu, mais plus maintenant) à la verticale avec un couvercle ouvert.
NOTE: Les temps de séchage dépendent fortement de l’incubateur utilisé et les plaques fortement séchées ne permettront pas l’essaimage de V. parahaemolyticus. (Cette étape est très importante !) Les assiettes doivent être utilisées fraîches et ne doivent pas avoir plus de 2 à 3 h. Les vieilles assiettes seront trop sèches pour stimuler l’essaimage.

6. Inoculez une petite quantité de cellules du bord d’une seule colonie dans 5 ml de bouillon Luria-Bertani (LB). Incuber la culture en l’agitant à 37 °C jusqu’à ce que OD₆₀₀ = 0,8 soit atteint, cela prend généralement environ 2-3 heures. Après cela, les cellules sont prêtes à être repérées sur les plaques de gélose d’essaimage HI.

7. Repérez 1 μL de culture cellulaire au centre d’une plaque d’essaimage de gélose HI (Figure 1A).

8. Laissez sécher la tache (Figure 1B).

9. Scellez la plaque avec du ruban adhésif en plastique transparent et assurez-vous qu’elle est bien fixée, sinon elle pourrait se détacher pendant la nuit d’incubation (figure 1C).

NOTE: Il est très important que l’étanchéité soit parfaite. Évitez la formation de bulles d’air et de plis sur le ruban lorsqu’il est appliqué.

10. Incuber la plaque à 24 °C pendant la nuit. Cela se traduira par la formation d’une colonie d’essaim de V. parahaemolyticus avec des éruptions d’essaim s’étendant de la périphérie de la colonie d’essaim (Figure 2).

Résultats

Figure 1 : Induction de la différenciation de l’essaim et préparation des cellules pour l’imagerie microscopique. Visualisation simplifiée du flux de travail pour produire des cellules d’essaim de V. parahaemolyticus ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Composants multimédias
LB moyen	Roth	X968.3
Gélose Difco, granulée	BD	214510	Pour la préparation de la gélose LB avec un milieu LB
Gélose à l’infusion cardiaque Difco	BD	244400	Pour la préparation des plaques d’essaimage de gélose HI
Agarose NEEO, ultra qualité	Roth	2267.3	Pour la préparation des tampons d’agarose de microscopie
Additifs
2,2'-bipyridyle	Sigma Aldrich	D216305-25G	Pour la préparation des plaques d’essaimage de gélose HI
Chlorure de calcium dihydraté	Roth	5239.1	Pour la préparation des plaques d’essaimage de gélose HI
Matériel
Boîte de Pétri 150 mm x 20 mm avec cames	Sarstedt	82.1184.500	Pour la préparation des plaques d’essaimage de gélose HI
kelvitron t (B 6420)	Hérée	-	Utilisé pour le séchage des plaques d’essaimage de gélose HI